鋁誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞程序性死亡及其信號(hào)調(diào)控研究.pdf

1、鋁(aluminum，Al)毒害嚴(yán)重影響著酸性土壤中農(nóng)作物的產(chǎn)量，因此，Al毒和耐Al機(jī)制已成為植物逆境生物學(xué)研究的焦點(diǎn)之一。目前，對(duì)有機(jī)酸胞外排Al機(jī)制的研究已達(dá)到基因調(diào)控的水平，但對(duì)胞內(nèi)耐Al的機(jī)制還知之甚少。Al能否誘導(dǎo)植物細(xì)胞發(fā)生程序性死亡(programmedcell death，PCD)，PCD的負(fù)調(diào)控是否是潛在的耐Al機(jī)制，以及Al脅迫與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)之間有何聯(lián)系等問題已逐漸引起科學(xué)家們的興趣和關(guān)注。本研究以真核模式生物酵

2、母為主要的研究對(duì)象，利用其簡(jiǎn)單的遺傳背景、較短的生長(zhǎng)周期、豐富的突變體材料以及進(jìn)化上的保守性等優(yōu)點(diǎn)，為解答上述問題進(jìn)行了探索。本研究的結(jié)果可以概括為幾個(gè)方面： (1)通過摸索建立酵母實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)易方法，比如用醋酸鋰法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞，用蝸牛酶去壁法提取酵母總DNA，剛自行設(shè)計(jì)和制作的玻璃儀器測(cè)定酵母生長(zhǎng)曲線。發(fā)現(xiàn)1-4 mMAl處理可以加快酵母細(xì)胞生長(zhǎng)，尤以2 mM Al最顯著。酵母接種后的初始細(xì)胞濃度越低，Al促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的效

3、應(yīng)就越明顯。用血球板計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞術(shù)證明2 mM Al處理促進(jìn)酵母細(xì)胞分裂。 (2)通過DAPI染色在普通熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)，用TUNEL法在激光共聚焦顯微鏡下觀察DNA鏈的斷裂，利用掃描電鏡和透射電鏡分別觀察酵母細(xì)胞的表面和內(nèi)部特征、運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定DNA含量，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證明Al誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是PCD的過程。 (3)用RACE方法從早竹的花組織中成功克隆Bax抑制基因PpBI-I的3’和5’端cD

4、NA，拼接后獲得推定的cDNA全長(zhǎng)序列。在推定的開放閱讀框外圍設(shè)計(jì)PCR引物，仍以RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用高保真酶再次擴(kuò)增后得到真實(shí)的編碼序列，用于基因功能研究。 (4)從多方收集各種質(zhì)粒和酵母菌株。將PpBI-1、動(dòng)物凋亡抑制基因Ced-9和Bcl-2分別構(gòu)建于酵母表達(dá)載體pGilda或pYX112，轉(zhuǎn)化酵母EGY48或BF264-15Dau。提取轉(zhuǎn)基因酵母總DNA，用PCR驗(yàn)證陽性克隆。由載體pGilda表達(dá)的蛋白產(chǎn)物中

5、具有融合抗原LexA，因此使用anti-LexA通用抗體檢驗(yàn)凋亡抑制蛋白是否正確表達(dá)。構(gòu)建含融合片段印PpBi-1-GFP的兩個(gè)酵母表達(dá)載體，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到LexA-PpBI-1-GFP主要定位于細(xì)胞核周邊區(qū)域。測(cè)定酵母在液體或固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)率、存活率、PI膜通透率等指標(biāo)，表明凋亡抑制基因Ced-9、Bcl-2和PpBI-1具有一定的耐Al功能，其中Bcl-2可能發(fā)揮了抑制酵母細(xì)胞分裂和細(xì)胞死亡的艤功能。 (5

6、)發(fā)現(xiàn)凋亡抑制基因可以顯著延長(zhǎng)酵母細(xì)胞冷凍保存的時(shí)間，并增強(qiáng)恢復(fù)生長(zhǎng)的能力。因此，對(duì)酵母冷脅迫誘導(dǎo)的凋亡進(jìn)行了初步研究，觀察到明顯的染色質(zhì)環(huán)化現(xiàn)象。另外還發(fā)現(xiàn)，酵母谷胱甘肽(GSH)合成酶的缺陷造成對(duì)冷脅迫的敏感，而PpBI-1耐冷的效果可能與GSH的協(xié)同作用有關(guān)。 (6)用特異的熒光染料結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，發(fā)現(xiàn)凋亡抑制基因Ced-9、Bcl-2@IPpBI-1不能抑制Al誘導(dǎo)的活性氧自由基(reactive oxygen spe

7、cies，ROS)水平增加，卻可以直接調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子(Ca<'2+>)水平。這個(gè)結(jié)果暗示，凋亡抑制基因是作用TAl誘導(dǎo)的RoS下游途徑或不依賴于ROS的另一條途徑中，很可能調(diào)控鈣信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在酵母突變體鈣敏感性測(cè)試的基礎(chǔ)上，篩選出對(duì)Al脅迫敏感的酵母液泡Ca<'2+>/ATPase(Pmcl)突變株K605，為后續(xù)研究提供了新的切入點(diǎn)。為Tab除非特異性，做了一系列其它脅迫處理的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明突變株K605對(duì)Al<'3+>、H<

8、,2>O<,2>和Ca<'2+>顯著敏感，對(duì)山梨醇或甘露醇高滲處理以及銅離子(Cu<'2+>)或鎘離子(Cd<'2+>)等脅迫均不敏感。 (7)構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBLA-13011-PpBI-1和pERS-PpBI-1，將pER8-PpBI-1轉(zhuǎn)化擬南芥當(dāng)代(TO)，獲得轉(zhuǎn)基因小苗(T1)，收取種子(T2)保存。統(tǒng)計(jì)T2代的種子(T3)在潮霉素培養(yǎng)基上的分離比，從而確定T2代的1-3、2-1、2-2和3-9為純合母本。然

9、后，提取基因組DNA，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因PpBI-1是否已經(jīng)整合，結(jié)果只有1號(hào)和2號(hào)株系是轉(zhuǎn)基因陽性，因此選擇PCR陽性的1-3和2-2的后代(T3)以及1-3-4和12-2-5的后代(T4)做進(jìn)一步分析。RT-PCR的結(jié)果是，1-3-4的后代(T4)不用雌二醇誘導(dǎo)也能表達(dá)，且表達(dá)量較高；2-2-5后代(T4)用雌二醇誘導(dǎo)才能表達(dá)，且表達(dá)量較低。 在上述工作的基礎(chǔ)上，我們面臨一些新的疑問和挑戰(zhàn)，如酵母Pmcl和植物中類似的基岡是否都是