肺炎克雷伯菌可移動(dòng)基因組的研究.pdf

1、革蘭氏陰性腸桿菌科肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是醫(yī)源性感染最重要的條件致病菌之一。隨著抗菌素的泛用，多重耐藥性正在它們中廣泛傳播，給臨床抗感染治療帶來極大的困擾。研究發(fā)現(xiàn)許多與致病和耐藥等相關(guān)的基因，可借助接合性質(zhì)粒、插入序列元件、整合子和基因組島(Genmomic islands)等可移動(dòng)遺傳元件進(jìn)行廣泛傳播，這些可移動(dòng)遺傳元件組成了可移動(dòng)基因組(mobile genome, or‘mobilome’)。

2、其中，基因組島在細(xì)菌的進(jìn)化機(jī)制、致病機(jī)理和抗菌素抗性中扮演著重要的角色。目前，基因組島已在多種腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，但對于K. pneumoniae基因組島的研究卻鮮有報(bào)道。
　　本研究通過采用生物信息學(xué)工具 MobilomeFINDER，對4株已測序 K. pneumoniae基因組(MGH78578, NTUH-K2044, Kp342 and KCTC2242)中的87個(gè)tRNA/tmRNA基因位點(diǎn)進(jìn)行分析，共識別出8個(gè)

3、tRNA/tmRNA基因作為外源DNA片段的插入熱點(diǎn)。采用tRIP-PCR策略考察了36株環(huán)境和臨床分離的K. pneumoniae菌株在這8個(gè)插入熱點(diǎn)中基因組島的分布情況，揭示了在不同生態(tài)環(huán)境下K. pneumoniae的遺傳多樣性。通過構(gòu)建3個(gè)位點(diǎn)特異的酵母捕捉載體，并利用酵母同源重組系統(tǒng)成功克隆6個(gè)新島(9~36 kb)，實(shí)現(xiàn)了精確定向克隆K. pneumoniae染色體中大片段DNA的方法，為進(jìn)一步克隆其它臨床和環(huán)境菌株基因組島

4、奠定了基礎(chǔ)。
　　同時(shí)，本研究對克隆的兩個(gè)插入到tmRNA基因位點(diǎn)的新島tmGI_Kpw49和tmGI_Kp35進(jìn)行了初步的序列和功能分析。從水稻根際分離的K. pneumoniae w49中的一個(gè)9.6 kb島 tmGI_Kpw49,生物信息學(xué)預(yù)測其涉及 L-艾杜糖酸(L-idonate)的分解代謝，該代謝島可能在 w49菌株和植物的共生過程中扮演著重要的角色。從病人傷口分泌物中分離的K. pneumoniae HS04035中

5、的一個(gè)36.6 kb島tmGI_Kp35,編碼一個(gè)整合到宿主染色體上的P2-like噬菌體。序列比對發(fā)現(xiàn)該類型噬菌體整合在多種已測序腸桿菌科細(xì)菌的染色體上。通過文獻(xiàn)收集和生物信息學(xué)預(yù)測，系統(tǒng)地比較分析了已知和預(yù)測的P2-like噬菌體，發(fā)現(xiàn)該類型噬菌體，除含有保守的結(jié)構(gòu)基因外，常攜帶編碼致病因子等重要的特異性基因，表明其在腸桿菌科細(xì)菌的致病和遺傳多樣性上扮演著重要的角色。
　　基于36株環(huán)境和臨床分離的K. pneumoniae菌

6、株的tRIP-PCR篩查結(jié)果，本研究對一株臨床分離的泛耐藥K. pneumoniae HS11286菌株進(jìn)行了全基因組測序。HS11286菌株是2011年初從華山醫(yī)院一病人的痰液中分離的，具有廣譜的耐藥性，屬于碳青霉烯酶產(chǎn)生菌。通過454測序、拼裝和補(bǔ)gaps，獲得了7個(gè)環(huán)形的復(fù)制子，包含一條染色體和六個(gè)質(zhì)粒。HS11286染色體大小為5,333,942 bp，GC含量為57.5％，注釋出5316個(gè)蛋白編碼基因，87個(gè)tRNA基因，1個(gè)

7、tmRNA基因和8套rRNA操縱子(16S-23S-5S)。通過與已測序的4株K. pneumoniae的模擬消減雜交分析，共識別出422個(gè)HS11286菌株特異的基因。進(jìn)一步在HS11286基因組中識別出9個(gè)基因組島，其中7個(gè)為前噬菌體，另外2個(gè)為整合性接合元件。HS11286菌株中含有6個(gè)天然質(zhì)粒，包括3個(gè)為耐藥性質(zhì)粒(～110 kb)，和3個(gè)大小為1～4 kb的小質(zhì)粒。質(zhì)粒pKPHS1推測為致病相關(guān)的整合型質(zhì)粒，同時(shí)編碼β內(nèi)酰胺酶

8、CTX-M-14。質(zhì)粒pKPHS2和pKPHS3均為多重抗性質(zhì)粒，前者攜帶編碼碳青霉烯酶基因 blaKPC-2，是碳青霉烯類藥物耐藥的主要機(jī)制；而后者攜帶約10種重要的抗性基因。同時(shí)，兩者都攜帶接合轉(zhuǎn)移相關(guān)的tra基因，可能導(dǎo)致耐藥基因在不同細(xì)菌中的轉(zhuǎn)播。3個(gè)小質(zhì)粒 pKPHS4、pKPHS5和pKPHS6編碼功能未知的蛋白，其中，1.3 kb的質(zhì)粒pKPHS6是目前肺炎克雷伯中報(bào)道的最小質(zhì)粒。
　　多重耐藥革蘭氏陰性條件致病菌已