光動(dòng)力療法對(duì)MRSA及其生物被膜作用的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　研究新型光敏劑亞芐基環(huán)戊酮化合物(P2)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法(Photodynamictherapy, PDT)對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）及其生物被膜的體外作用。
　　方法：
　　(1)將3株MRSA臨床菌株配制成濃度為2×108 CFU/ml的細(xì)菌懸液，與濃度為5、10、20、50μM的光敏劑P2溶液等體積混勻，孵育30min，用波長(zhǎng)為532nm、功率密度40mW/cm2的連續(xù)激光照射10min，

2、能量密度為24 J/cm2。并設(shè)空白對(duì)照組、單純光敏劑組及單純光照組。每組3個(gè)樣本，重復(fù)3次。處理后即刻采用稀釋平板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，評(píng)價(jià)P2-PDT對(duì)MRSA浮游菌的體外殺傷效果。
　　(2)培養(yǎng)MRSA0生物被膜，按方法(1)進(jìn)行P2-PDT處理（P2濃度為10μM）。處理后，采用SYTO9（標(biāo)記活細(xì)菌，顯示綠色熒光）、PI（標(biāo)記死細(xì)菌，顯示紅色熒光）熒光探針標(biāo)記膜內(nèi)細(xì)菌，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜內(nèi)細(xì)菌的死亡情況。培養(yǎng)M

3、RSA0生物被膜，按方法(1)進(jìn)行P2-PDT處理(P2濃度為10、25μM)，并設(shè)空白對(duì)照組、單純光敏劑組及單純光照組。每組6個(gè)樣本，重復(fù)3次。處理后，采用XTT法檢測(cè)生物被膜內(nèi)細(xì)菌的存活率。
　　(3)培養(yǎng)MRSA0生物被膜，按方法(1)進(jìn)行P2-PDT處理（P2濃度為10、25μM）。采用結(jié)晶紫染色法光鏡下觀察生物被膜致密度、菌落形態(tài)以及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的變化，并用酶標(biāo)儀定量檢測(cè)生物被膜的破壞程度。采用FITC-Cona（產(chǎn)生綠色熒

4、光）熒光探針標(biāo)記被膜中的多糖，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察多糖的變化。在微孔濾膜管內(nèi)培養(yǎng)MRSA0生物被膜，按方法(1)對(duì)其進(jìn)行P2-PDT處理（P2濃度為10μM），處理后加入10μg/ml左氧氟沙星(Levofloxacin, LVFX)溶液400μl，孵育6小時(shí)后采用高壓液相色譜儀檢測(cè)透過(guò)生物被膜的LVFX的濃度。并設(shè)空白對(duì)照組。每組6個(gè)樣本。
　　(4)P2-PDT與LVFX聯(lián)合殺傷生物被膜內(nèi)細(xì)菌在96孔板中進(jìn)行，按方法(1)

5、對(duì)MRSA0生物被膜進(jìn)行P2-PDT處理后（P2濃度為10μM），分別加入濃度為10μg/ml與20μml的LVFX溶液，24 h后XTT法檢測(cè)生物被膜內(nèi)細(xì)菌的存活率。并設(shè)空白對(duì)照組、單純LVFX組及單純PDT組。每組6個(gè)樣本。比較各組細(xì)菌存活率。
　　結(jié)果：
　　(1)P2-PDT對(duì)3株MRSA臨床菌株均有不同程度的殺傷作用。當(dāng)光敏劑P2濃度為5μM時(shí)，3株MRSA臨床菌株的菌落數(shù)均下降3 log10以上，達(dá)到有效殺傷;P

6、2濃度為10μM時(shí)，達(dá)到最大殺傷。
　　(2)激光共聚焦顯微鏡觀察到，經(jīng)P2-PDT處理的生物被膜內(nèi)綠色熒光的平均強(qiáng)度(299.84 a.u.±53.39 a.u.)明顯弱于對(duì)照組(485.44 a.u.±120.21 a.u.)(P＜0.01)，在綠色熒光與紅色熒光的混合圖像中，綠色熒光所占比例(31.87％±6.25％)明顯低于空白對(duì)照組(61.67％±11.07％)(P＜0.01)，表明生物被膜內(nèi)細(xì)菌死亡數(shù)量增加。XTT結(jié)果

7、顯示，PDT后生物被膜內(nèi)細(xì)菌存活率明顯下降，P2濃度25μM組的殺菌作用強(qiáng)于10μM組(P＜0.05)，25μM組細(xì)菌存活率為6.25％±1.7％，10μM組細(xì)菌存活率為15.77％±3.5％。
　　(3)光鏡下可見(jiàn)PDT后生物被膜致密度降低，菌落變得稀疏，呈點(diǎn)狀分布，菌落間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，光敏劑濃度25μM組破壞程度強(qiáng)于10μM組。定量分析發(fā)現(xiàn)，PDT組的OD值低于空白對(duì)照組，且P2濃度25μM組的OD值(1.046±0.157)

8、明顯低于10μM濃度組(1.283±0.280)(P＜0.01)。激光共聚焦顯微鏡觀察到，經(jīng)P2-PDT處理的生物被膜內(nèi)的綠色熒光強(qiáng)度(183.41 a.u.±0.31 a.u.)明顯弱于空白對(duì)照組(474.57 a.u.±117.26 a.u.)(P＜0.01)，表明生物被膜內(nèi)多糖減少。經(jīng)P2-PDT處理后，生物被膜對(duì)LVFX的滲透性增強(qiáng)，即PDT組LVFX濃度為2.016±0.348μg/ml，空白對(duì)照組為1.602±0.474μg

9、/ml(P＜0.01)。
　　(4)P2-PDT與LVFX聯(lián)合應(yīng)用對(duì)生物被膜內(nèi)細(xì)菌的殺傷作用。四組生物被膜內(nèi)細(xì)菌的存活率分別為:A組為(100.00±0)％、B組(86.49±3.5)％、C組(57.42±0.9)％、D組(0.76±0.6)％，其中D組生物被膜內(nèi)細(xì)菌的存活率顯著低于B組和C組，三組比較差異有非常顯著意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.P2-PDT在體外能夠有效殺傷MRSA臨床菌株的浮游菌。