細(xì)菌生物被膜體外模型的建立及重組溶葡球菌酶對葡萄球菌生物被膜的體外清除作用.pdf

1、細(xì)菌生物被膜(bacterial biofilm，BBF)是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境，在生長過程中附著于固體表面或破損組織表面而形成的特殊存在形式，是由多細(xì)菌組成的膜狀結(jié)構(gòu)。生物被膜中的細(xì)菌由于被膜的屏障保護(hù)作用，能抵御外來攻擊，并且能逃避機(jī)體的免疫攻擊，不易被機(jī)體內(nèi)的抗體溶解和巨噬細(xì)胞吞噬，是造成持續(xù)感染的主要原因，多數(shù)的人類細(xì)菌性感染與生物被膜相關(guān)。細(xì)菌生物被膜廣泛存在于自然界中，只要條件允許，任何細(xì)菌都可形成生物被膜，其中葡萄球菌是較易

2、形成生物被膜的菌種之一，也是臨床中導(dǎo)致難治性感染的主要原因，由于生物被膜的特殊結(jié)構(gòu)及特性，使得生物被膜內(nèi)的細(xì)菌可對抗多數(shù)抗生素的殺菌作用，因此，如何清除細(xì)菌生物被膜成為近年來的研究熱點(diǎn)，早在六、七十年代溶葡球菌酶對葡萄球菌尤其是金葡菌的較強(qiáng)殺菌作用就已得到很多研究人員的重視，本實驗首先研究了生物被膜的體外模型建立方法，探討了各種影響因素對生物被膜形成的影響，在此模型的基礎(chǔ)上，研究了重組溶葡球菌酶對葡萄球菌生物被膜的體外清除作用。

3、 一、細(xì)菌生物被膜體外模型的建立在這部分實驗研究中，著重于摸索生物被膜體外模型的建立條件，首先將傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法與引導(dǎo)片培養(yǎng)法進(jìn)行比較，傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法以結(jié)晶紫染色，測定吸光度值為首選檢測方法，最終測得的結(jié)果穩(wěn)定性較差，引導(dǎo)片培養(yǎng)法主要以超聲震蕩—活菌計數(shù)法為定量監(jiān)測方法，最終所得的結(jié)果較穩(wěn)定，試驗重復(fù)性較好，在此基礎(chǔ)上，以引導(dǎo)片法體外培養(yǎng)生物被膜，比較硅橡膠與玻璃兩種不同材質(zhì)作為黏附載體以及分別使用營養(yǎng)肉湯和TSB肉湯作為培養(yǎng)基時對生

4、物被膜形成的影響，結(jié)果顯示，以硅橡膠作為黏附載體所形成的生物被膜超聲震蕩--活菌計數(shù)值在幾組實驗中均高于以玻璃為黏附載體，因此硅橡膠是作為引導(dǎo)片的較好材質(zhì)，以TSB肉湯作為培養(yǎng)基時所形成的生物被膜超聲震蕩--活菌計數(shù)值在幾組實驗中均高于以營養(yǎng)肉湯作為培養(yǎng)基時，因此TSB肉湯的營養(yǎng)成分較適宜生物被膜的體外培養(yǎng)，最后以引導(dǎo)片法為生物被膜體外培養(yǎng)方法，硅橡膠作為黏附材質(zhì)，TSB肉湯為培養(yǎng)基，觀察不同時間點(diǎn)和溫度對生物被膜形成的影響，并且以超聲

5、震蕩--活菌計數(shù)法為定量監(jiān)測方法，掃描電鏡為定性檢測方法，兩個監(jiān)測指標(biāo)同時反映時間和溫度對生物被膜形成的影響，并反映出生物被膜的動態(tài)生長過程，結(jié)果顯示，37℃時生物被膜的生長狀態(tài)較22℃更好，生物被膜在24hr，48hr，72hr三個時間點(diǎn)呈不斷生長的狀態(tài)，在72hr時間點(diǎn)形成較為成熟的生物被膜。 二、重組溶葡球菌酶對葡萄球菌生物被膜的體外清除作用以臨床常用的抗金葡菌藥物去甲萬古霉素作為對照藥，研究重組溶葡球菌酶對葡萄球菌生物被

6、膜的體外清除作用，其中一株表葡菌ATCC12228生物被膜形成能力缺陷，作為陰性對照，其他兩株金葡菌和一株表葡菌3-26具有形成生物被膜的能力，兩藥物的作用濃度為MIC-100MIC，對于表葡菌ATCC12228將藥物濃度在降低一個等級即1/10MIC～10MIC。分別在2hr，4hr，8hr，24hr四個時間點(diǎn)取出經(jīng)兩藥物各濃度作用后兩株金葡菌的引導(dǎo)片，以超聲震蕩-活菌計數(shù)法所計得的活菌數(shù)反映藥物的作用強(qiáng)度，并將重組溶葡球菌酶MIC濃

7、度和去甲萬古霉素100MIC濃度作用后的引導(dǎo)片及對照引導(dǎo)片制作電鏡樣本，送掃描電鏡觀察；表葡菌3-26僅在24hr時間點(diǎn)取出經(jīng)兩藥物各濃度作用后的引導(dǎo)片，再以與兩株金葡菌相同的處理方法進(jìn)行處理；表葡菌ATCC12228的電鏡樣本為重組溶葡球菌酶MIC濃度和去甲萬古霉素MIC濃度作用后的引導(dǎo)片，其他處理過程同表葡菌3-26。重組溶葡球菌酶對兩株金葡菌的效果較明顯，各藥物濃度作用后的活菌計數(shù)值隨時間點(diǎn)的延長依次下降，MIC濃度作用后的電鏡圖

8、片與對照電鏡圖片差別明顯，去甲萬古霉素對兩株金葡菌的效果較差，各藥物濃度作用后的活菌計數(shù)值無明顯波動，100MIC濃度作用后的電鏡圖片與對照電鏡圖片相比無明顯差別；重組溶葡球菌酶對表葡菌3-26有一定的效果，但不及對金葡菌的效果好，去甲萬古霉素對表葡菌3-26依然無明顯效果，電鏡圖片與計數(shù)結(jié)果相吻合；重組溶葡球菌酶和去甲萬古霉素對表葡菌ATCC12228都具有較好的效果，雖然將兩藥物的濃度降低了一個等級，但計數(shù)結(jié)果也相應(yīng)降低，重組溶葡球