AAT失代償在脂肪肝大鼠急性胰腺炎中的作用和機制研究.pdf

1、研究背景：
　　急性胰腺炎（AP）是胰腺的一種炎癥性疾病，大多數(shù)患者病程為自限性，預(yù)后良好，但有一部分患者病情較重，常常進(jìn)展為致命的重癥急性胰腺炎（SAP）。SAP的總死亡率接近20％。SAP的危險因素包括酒精、肥胖、阿片類藥物以及非酒精性脂肪肝（NAFLD,也被稱為肝脂肪變）。NAFLD不是一種特異的疾病，而是一種臨床上非常普遍的現(xiàn)象。它以肝細(xì)胞的炎癥、壞死和凋亡為特征，發(fā)病率在全世界人口中高達(dá)10-24%。
　　脂肪肝加

2、重胰腺炎的機制至今尚未完全闡明。然而目前有以下幾種可能的機制。脂肪肝常常合并高脂血癥，而后者可以引起胰腺微循環(huán)障礙、氧化應(yīng)激、游離氧自由基的積聚以及導(dǎo)管壞死。高脂血癥還能削弱紅細(xì)胞的攜氧能力，增加血紅蛋白的氧親和力從而導(dǎo)致組織缺氧。而且游離的氧自由基和氧化應(yīng)激也會促進(jìn)胰腺炎的進(jìn)展，甘油三酯的代謝產(chǎn)物也會加劇胰腺導(dǎo)管的損傷。脂肪肝確實能夠從許多方面促進(jìn)胰腺炎的進(jìn)展。α-1抗胰蛋白酶（AAT）是一種可以穿過組織的水溶性的糖蛋白，超過80%的

3、AAT是由肝細(xì)胞合成分泌。此外巨噬細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞也能合成。當(dāng)組織損傷時AAT合成增加，因此它又被稱為急性反應(yīng)期蛋白。除了抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶外，AAT還抑制cathepsin-G和proteinase-3之類的蛋白水解酶。然而在一些情況下AAT的活性是降低的，例如吸煙的有害成分過氧化氫可以使AAT失活。AAT的缺乏會導(dǎo)致蛋白酶和其抑制劑間的平衡被打破，從而促使COPD，肝硬化，肝癌等許多疾病的進(jìn)展。然而AAT

4、在急性胰腺中的作用機制尚未完全闡明。
　　本研究中我們成功建立了脂肪肝胰腺炎大鼠模型（HSAP）和非脂肪肝胰腺炎大鼠模型（NHSAP）,首先我們采用蛋白組學(xué)的方法篩選HSAP和NHSAP血清差異表達(dá)蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AAT蛋白在兩組間差異表達(dá)顯著，接著我們又使用臨床血清樣本進(jìn)行了驗證。為了進(jìn)一步探索脂肪肝加重胰腺炎的分子機制，我們采用RNA-seq高通量測序的方法分析HSAP和NHSAP組間差異表達(dá)基因和相關(guān)分子通路，為臨床應(yīng)用奠定基

5、礎(chǔ)。
　　研究一
　　目的：
　　探索HSAP和NHSAP間差異表達(dá)蛋白
　　方法：
　　使用?；悄懰徕c逆行胰膽管注射的方法建立大鼠急性胰腺炎模型。采用二維凝膠電泳和質(zhì)譜鑒定的方法篩選脂肪肝胰腺炎大鼠與非脂肪肝胰腺炎大鼠血清中差異表達(dá)的蛋白。為了驗證蛋白組學(xué)的結(jié)果，我們用ELISA的方法檢測了正常飲食組（ND），高脂飲食組（HFD），非脂肪肝胰腺炎組（NHSAP組），脂肪肝胰腺炎組（HSAP組）4組血清中A

6、AT的含量，接著采用Western blot和免疫組化做進(jìn)一步的驗證。
　　結(jié)果：
　　我們成功建立了HSAP與NHSAP模型，二維凝膠電泳圖顯示共有14個表達(dá)下調(diào)的蛋白，4個表達(dá)上調(diào)的蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定AAT為兩組間差異表達(dá)的蛋白之一。ELISA結(jié)果顯示：HSAP組血清AAT含量與NHSAP組相比明顯下降，與蛋白組學(xué)的結(jié)果一致。免疫組化的結(jié)果同樣顯示HSAP組AAT的表達(dá)量與NHSAP組相比明顯下降。
　　結(jié)論

7、　　綜上所述，我們通過動物實驗證明了脂肪肝大鼠在發(fā)生胰腺炎時血清中AAT處于失代償狀態(tài)。
　　研究二
　　目的：
　　探索肝脂肪變性時AAT變化與AP的病程關(guān)系
　　方法：
　　采用ELISA的方法檢測健康對照組（NC）、脂肪肝組（FLD）、非脂肪肝胰腺炎組（NHSAP）和脂肪肝胰腺炎組（HSAP）4組血清中AAT的含量。將以上4組符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病人靜脈采血，室溫放置半小時后860g，15min，4℃離心后

8、獲得血清，并將其保存于-80℃冰箱。分析HSAP組血清AAT與APACHE-II評分間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　ELISA檢測AAT在 HSAP組的水平：1.63±0.34 mg/ml(range:0.74-2.59 mg/ml)；正常組2.54±0.21 mg/ml(range:2.16-2.90 mg/ml)；NHSAP組為3.92±0.37 mg/ml(range:3.1-4.78 mg/ml)；FLD組為2.30±0

9、.27 mg/ml(range:1.81-2.69 mg/ml)。APACHE-II評分和HSAP病人血清AAT水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.85, P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　脂肪肝病人在發(fā)生胰腺炎后 AAT的合成處于失代償狀態(tài)，脂肪肝導(dǎo)致的AAT下調(diào)會加重胰腺炎病情。
　　研究三
　　目的：
　　利用RNA-seq技術(shù)比較脂肪肝胰腺炎（APFL）與非脂肪肝胰腺炎（AP）發(fā)病機制的異同
　　方法：<

10、br>　　采用高通量測序RNA-seq技術(shù)分析APFL與AP間差異表達(dá)的基因，之后將這些差異基因進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集分析，最后使用RT-PCR驗證差異表達(dá)基因。
　　結(jié)果：
　　KEGG結(jié)果顯示PPARγ信號通路以及所調(diào)節(jié)的脂肪酸代謝通路和JAK/SATA炎癥通路參與到APFL和AP的病理過程中，并且在APFL組中的富集程度更為明顯。qRT-PCR驗證參與到PPAR信號通路和脂肪酸代謝通路的部分基因，與RNAs