Reg蛋白在重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障中的作用及其機制的研究.pdf

1、目的:重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是臨床常見的急腹癥，其發(fā)病急、病情進展快，并發(fā)癥多，目前病死率仍高達30％。近幾年研究顯示SAP時腸黏膜屏障功能受損，容易發(fā)生腸屏障功能障礙(intestine barrier functional disturbance，IBFD)，使腸黏膜通透性增加，是導致腸道細菌及內(nèi)毒素發(fā)生移位，加速敗血癥的進程，誘發(fā)和加重全身炎癥反應綜合征(systemic in

2、flammatory response syndrome，SIRS)、多器官功能障礙綜合癥(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，甚至會引起死亡，因此在治療原發(fā)病的同時對腸黏膜屏障的保護至關重要。近年來胰島再生源蛋白(regenerating islet-derived protein，Reg)在SAP發(fā)生發(fā)展過程中的作用日益引起廣泛關注。
　　Reg蛋白是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類多功能分子，

3、屬C型凝集素超家族，大量研究表明Reg蛋白在多種生理、病理活動中發(fā)揮重要作用，在SAP發(fā)生發(fā)展過程中與促進細胞增殖、調(diào)控小學校細胞凋亡、抑制炎癥因子過表達及抑制損傷部位周圍病原微生物生長和擴散等功能有關，尤其再生基因RegⅠ、Ⅲ在急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)中的作用日益受到重視，現(xiàn)已有研究表明Reg可通過抑制NF-κB入核來調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6等誘導的炎癥因子的過表達從而抑制炎癥的發(fā)生，還有研究顯示IL-2

4、2可以調(diào)節(jié)Reg的表達，來抑制損傷部位細菌生長，但其在SAP時腸黏膜損害中的作用研究甚少。
　　本實驗旨在通過測定RegⅠ、Ⅲ蛋白及mRNA在SAP大鼠小腸中的表達，評價RegⅠ、Ⅲ水平與腸黏膜屏障損傷的關系;并通過分析應用特異性NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)預處理后的小腸RegⅠ、Ⅲ的變化，初步探討Reg蛋白家族與NF-κB通路的關系。
　　方法:1

5、、實驗分組120只成年SD大鼠分為對照組（N組）、重癥急性胰腺組（S組）、1mg/kgPDTC+重癥急性胰腺炎組（P1組）、10mg/kgPDTC+重癥急性胰腺炎組(P10組)、100mg/kgPDTC+重癥急性胰腺炎組(P100組)，各為12小時及24小時兩組，共10組每組12只大鼠。
　　2、制造模型:本研究采20％L-精氨酸腹腔注射，間隔一小時制作大鼠SAP模型。S組腹腔注射20％L-精氨酸2.5g/kg2次（總共5g/kg

6、大鼠質(zhì)量），間隔一小時，誘導重癥急性胰腺炎模型;N組于腹腔注射等體積0.9％氯化鈉;P1、P10、P100組:于造模前1小時腹腔注射PDTC1mg/kg、10mg/kg、100mg/kg預處理。各組造模成功后12小時及24小時取血、胰腺及小腸組織。
　　3、實驗方法:開腹后觀察胰腺、腸道及周圍組織情況，并通過蘇木素-伊紅(htoxylineosinHE)染色光學顯微鏡觀察胰腺、小腸的病理變化，ELISA方法檢測血清中IL-22、T

7、NF-α及(I)-FABP水平，采用熒光定量RT-PCR測定小腸組織中RegⅠ、ⅢmRNA表達含量，應用Westernblot檢測小腸組織中NF-κBp65及RegⅠ、Ⅲ蛋白水平。
　　4、統(tǒng)計學方法:應用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。設α=0.05，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1、HE染色，S組胰腺組織結構紊亂，間質(zhì)水腫明顯，可見腺泡細胞壞死及出血，炎性細胞浸潤，并隨著時間進展而漸進性加重。

8、腸道HE染色S組上皮細胞層壞死、脫落，部分絨毛形態(tài)不規(guī)則、部分脫落，固有層崩解，毛細血管擴張、充血，炎癥細胞的浸潤，24h較12h更嚴重。胰腺病理采用Schmidt評分、腸黏膜病理采用Chiu評分。結果顯示S組較N組明顯升高(P＜0.01)，且24h比12h更加嚴重(P＜0.05)，提示L-精氨酸可成功誘導重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障損傷模型。
　　2、應用不同劑量PDTC干預后發(fā)現(xiàn)無論12h或24h，P1及P10組大鼠胰腺及腸道

9、組織病理評分與S組比較明顯降低(P＜0.05)，P100組與S組比較胰腺及腸道組織評分無明顯差異(P＞0.05);P10組在12h腸道評分較P1組無明顯差異(P＞0.05)，而24hP10組評分較P1可見減低(P＜0.05);P100組較P1組無論12h或24h均有明顯升高(P＜0.05);腸道評分S、P124h組較12h組明顯升高(P＜0.05)。
　　3、血清IL-22:S組明顯高于N組（P＜0.01）;給予PDTC干預后，P

10、DTC不同劑量組與S組比較明顯降低(P＜0.05);與P1組比較，12h及24hP10組無明顯變化(P＞0.05)，而P100組較P1組可見明顯升高(P＜0.05);與P10組比較，P100組表達上升(P＜0.05);S組24hIL-22較12h明顯升高（P＜0.05）。
　　4、血清TNF-α:與N組比較S組TNF-α表達明顯升高(P＜0.01);應用PDTC干預后，與S組比較P1、P10組表達降低（P＜0.05），而P100組

11、較S組無明顯變化(P＞0.05);P10組TNF-α表達低于P1組(P＜0.05)，而P100組表達高于P1組(P＜0.05);S組、P100組24h較12h有明顯升高（P＜0.05）。
　　5、血清I-FABP:S組I-FABP表達明顯高于N組(P＜0.01);應用不同劑量PDTC干預后，與S組比較P1、P10組表達降低(P＜0.01)，而P100組較S組無明顯變化(P＞0.05);P10組I-FABP表達低于P1組(P＜0.0

12、5)，而P100組表達高于P1組(P＜0.05);S組24h較12h有明顯升高(P＜0.05)。
　　6、小腸NF-κBp65:與N組比較S組NF-κBp65表達明顯升高(P＜0.01);給予PDTC干預后，P1及P10組與SAP組比較表達降低（P＜0.05），而P100組較S組無明顯變化(P＞0.05);P10組NF-κBp65表達低于P1組(P＜0.05)，而P100組表達高于P1組(P＜0.05);S組24h較12hNF-κ

13、Bp65表達有明顯升高(P＜0.05)。
　　7、小腸RegⅠ、Ⅲ蛋白:S組RegⅠ、Ⅲ蛋白表達明顯均高于N組(P＜0.01);應用不同劑量PDTC干預后，與S組比較，P1、P10組表達降低(P＜0.01)，而P100組較S組無明顯變化(P＞0.05);P10組RegⅠ、Ⅲ蛋白低于P1組(P＜0.05)，而P100組表達高于P1組(P＜0.01);RegⅠ、Ⅲ蛋白S及P100組24h較12h有明顯升高(P＜0.05)。
　　

14、8、小腸RegⅠ、ⅢmRNA:與N組比較S組RegⅠ、ⅢmRNA表達明顯升高(P＜0.05);應用PDTC干預后，P1及P10組與S組比較表達降低(P＜0.05)，而P100組較S組無明顯變化（P＞0.05）;P10組RegⅢmRNA低于P1組(P＜0.05)，而P100組表達高于P1組(P＜0.05);而小腸組織中P10組RegⅠmRNA表達12h較P1組明顯降低(P＜0.05)，24h較P1組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），在24及1

15、2h均可見P100組高于P10組(P＜0.05);S24h組較12h明顯升高（P＜0.05）。
　　9、RegⅠ、Ⅲ蛋白表達與腸黏膜病理評評分、IL-22、I-FABP、TNF-α及NF-κBp65表達呈正相關。
　　結論:1、SAP大鼠小腸RegⅠ、Ⅲ表達增高，考慮RegⅠ、Ⅲ為腸黏膜屏障中調(diào)節(jié)因子之一，且其表達可能與IL-22、TNF-α等炎癥因子有關。
　　2、PDTC對于NF-κB通路抑制作用與劑量相關，1mg

16、/kg、10mg/kgPDTC抑制NF-κB通路活性，減輕SAP大鼠胰腺及腸屏障損傷，以10mg/kg作用更為明顯，100mg/kgPDTC不能減輕胰腺及腸屏障損傷，但不論12h或24h100mg/kgPDTC組各指標均未達到SAP組水平。
　　3、RegⅠ、Ⅲ基因表達可部分通過NF-κB通路調(diào)節(jié)，腸黏膜損傷或炎癥因子刺激致RegⅠ、Ⅲ表達上調(diào)，對黏膜損傷起起作用，其作用機制考慮為多個通路的共同調(diào)節(jié)，且不除外RegⅠ、Ⅲ基因之間的