以斑馬魚為模式動(dòng)物發(fā)現(xiàn)椎間盤重度受損引起椎骨退變.pdf

1、頸椎病是困擾口腔醫(yī)生的一種常見慢性疾病。研究表明，頸椎病發(fā)生的主要原因是以椎間盤退變?yōu)榛A(chǔ)的頸椎退行性變。椎間盤退變構(gòu)成大多數(shù)脊椎肌肉骨骼疾病的病理基礎(chǔ)，包括退行性椎管狹窄，椎間不穩(wěn)，頸椎綜合征等。骨質(zhì)疏松與椎間盤退變存在一定的相關(guān)性，骨質(zhì)疏松會(huì)引發(fā)甚至加重椎間盤退變。但是椎間盤與椎骨的發(fā)生發(fā)育、退變和再生修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜過程，確切分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。因此，對(duì)于椎間盤與椎骨的退變機(jī)制與自我修復(fù)機(jī)理的深入研究可為椎間盤退行性疾病與椎骨退

2、變的預(yù)防和治療提供理論指導(dǎo)。
　　目的：利用斑馬魚這類新型模式動(dòng)物來構(gòu)建椎間盤損傷模型，探討椎間盤重度損傷模型應(yīng)用于椎間盤退行性疾病的研究，為深入探究椎間盤退變與椎骨退變的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：通過分子克隆的生物學(xué)技術(shù)手段構(gòu)建重組質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR，借助顯微注射的方式將0.15ng經(jīng)純化過的重組質(zhì)粒注射到單細(xì)胞期的胚胎的動(dòng)物極，經(jīng)過三代連續(xù)傳代，我們培養(yǎng)出穩(wěn)定的

3、斑馬魚 Tg(twhh:Dendra2-NTR)轉(zhuǎn)基因魚系。利用Mtz/NTR系統(tǒng)對(duì)斑馬魚椎間盤的重度損傷來模擬椎間盤退變，組織切片HE染色觀察椎間盤與椎骨組織形態(tài)學(xué)的改變、TUNEL實(shí)驗(yàn)揭示椎間盤細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)，Micro CT掃描來評(píng)估椎體骨組織的微觀結(jié)構(gòu)差異、原位雜交檢測(cè)椎體中成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：通過分子克隆的生物學(xué)技術(shù)手段成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra

4、2-NTR。利用顯微注射的方式培育出穩(wěn)定的斑馬魚 Tg(twhh:Dendra2-NTR)轉(zhuǎn)基因魚系。借助激光共聚焦顯微鏡掃描 Tg(twhh:Dendra2-NTR)轉(zhuǎn)基因魚揭示斑馬魚椎間盤發(fā)育過程：在幼魚早期綠色熒光細(xì)胞標(biāo)記脊索細(xì)胞和底板細(xì)胞，茜素紅染色的紅色椎骨礦化是呈環(huán)形椎體的形式，從脊索的頭部向尾部逐漸發(fā)育的；在斑馬魚青年期綠色熒光細(xì)胞標(biāo)記椎間盤內(nèi)的纖維環(huán)和髓核細(xì)胞，茜素紅染色的紅色椎骨礦化開始向前后端和背腹側(cè)擴(kuò)展，每個(gè)礦化的

5、脊椎由椎體，神經(jīng)弓，血管弓三個(gè)部分組成，神經(jīng)弓和血管弓都處于椎骨體的前側(cè)邊緣；在斑馬魚成年期綠色熒光細(xì)胞特異性的標(biāo)記椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞，茜素紅染色的紅色椎骨發(fā)育完全成熟，將綠色標(biāo)記的椎間盤鑲嵌在其內(nèi)部，脊柱呈現(xiàn)明顯分段模式。利用激光共聚焦顯微鏡掃描顯示重度損傷的椎間盤綠色熒光細(xì)胞無法自我修復(fù)，茜素紅染色的紅色椎骨緊密相連、礦化障礙等椎骨退變的病理表型。脊柱組織切片的HE染色揭示椎間盤與椎骨組織的細(xì)胞形態(tài)方面的退變；椎間盤的細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯