異丙酚對人肝L02細胞糖氧剝奪-再灌注損傷時自噬的影響.pdf

1、肝臟缺血再灌注損傷（Hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI）是外科常見的病理生理過程。血液灌流量的減少使肝臟組織發(fā)生缺血性損傷，恢復(fù)血液灌流后，肝細胞功能代謝及結(jié)構(gòu)破壞反而加重。研究表明，細胞的凋亡和自噬存在于肝臟缺血再灌注過程中，肝臟缺血再灌注后細胞功能代謝障礙加重及結(jié)構(gòu)破壞會伴隨著自噬活性的升高。
　　自噬是真核細胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)，對細胞的存活是一把雙刃劍。生理情況下，

2、細胞維持低水平自噬，通過溶酶體系統(tǒng)對細胞質(zhì)內(nèi)大分子物質(zhì)和細胞器進行降解，促進細胞生存；而在氧化應(yīng)激、缺血再灌注等病理情況下，過度的自噬可導(dǎo)致細胞功能代謝障礙加重及結(jié)構(gòu)破壞甚至引起自噬性的肝細胞死亡。
　　異丙酚(propofol)是一種烷基酚類的非巴比妥類靜脈麻醉藥，具有高度脂溶性。因其起效迅速、誘導(dǎo)平穩(wěn)、蘇醒迅速而完全、持續(xù)輸注后不易蓄積等優(yōu)點普遍用于麻醉誘導(dǎo)、鎮(zhèn)靜及麻醉維持。目前認為，異丙酚能減輕缺血再灌注時的肝細胞損傷，改善

3、肝功能、保護肝臟結(jié)構(gòu)。但其保護作用的確切機制尚未完全清楚，可能與其清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、調(diào)節(jié)鈣離子平衡等作用有關(guān)。
　　目的：
　　本研究探討了：1.糖氧剝奪再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion, OGD/R）損傷對人肝L02細胞自噬的影響；2.異丙酚對人肝L02細胞OGD/R損傷時自噬的影響，為異丙酚在OGD/R損傷中的肝臟保護作用機制提供實驗依據(jù)。
　　方

4、法：
　　1.體外培養(yǎng)人肝L02細胞，制備糖氧剝奪再灌注損傷（OGD/R）模型，模擬臨床的肝臟缺血再灌注損傷。采用隨機數(shù)字表法將人肝L02細胞隨機分為5組：正常對照組（Control組）、糖氧剝奪6h/再灌注1h（OGD6/R1）組、糖氧剝奪6h/再灌注3h（OGD6/R3）組、糖氧剝奪6 h/再灌注6h（OGD6/R6）組和糖氧剝奪6 h/再灌注12h（OGD6/R12）組。隨后在倒置顯微鏡下觀察L02細胞形態(tài)；采用MTT比色法

5、檢測L02細胞的相對增殖情況；免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和P62的表達變化。
　　2.體外培養(yǎng)人肝L02細胞，對細胞進行糖氧剝奪6h再灌12h處理，建立OGD/R模型。根據(jù)是否進行OGD/R和是否加入異丙酚（PPF）及加入異丙酚的濃度，將細胞分為正常對照組（Control組）、糖氧剝奪再灌注（OGD/R）組、糖氧剝奪再灌注＋異丙酚10μmol/L（OGD/R+PPF10）組、糖氧剝奪再灌注＋異丙酚25μmo

6、l/L（OGD/R+PPF25）組、糖氧剝奪/再灌注＋異丙酚50μmol/L（OGD/R+PP50）組、糖氧剝奪再灌注＋異丙酚100μmol/L（OGD/R+PPF100）組。隨后在倒置顯微鏡下觀察L02細胞的形態(tài)改變；采用MTT比色法檢測L02細胞活力；免疫印跡（Western Blot, WB）法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1的表達變化；免疫熒光法檢測自噬小體的聚集。
　　3.統(tǒng)計方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對實

7、驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（ x?s）表示，組間數(shù)據(jù)的顯著性檢驗采用單因素方差分析，P<0.05確定為有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01確定為有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.糖氧剝奪再灌注損傷對人肝L02細胞形態(tài)的影響
　　與Control組相比，隨著再灌注時間的延長，OGD/R組處理L02細胞的形態(tài)損傷逐漸加劇，呈時間依賴性。
　　2.糖氧剝奪再灌注損傷對人肝L02細胞增殖活性的影響
　　與C

8、ontrol組比較，隨著再灌注時間的增加，L02細胞增殖活性逐漸降低，呈時間依賴性。再灌注1h時，細胞增殖率有所降低（P<0.05）;再灌注3h，6h，12h時，細胞增殖率顯著降低（P<0.01）。
　　3.免疫印跡法檢測糖氧剝奪再灌注損傷對人肝L02細胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和P62的表達的影響
　　與Control組比較，自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1在糖氧剝奪再灌注1h時即有所增高，隨著再灌注時間的

9、延長LC3的表達量逐漸增高并于再灌注6h時大量增加，于再灌注12h時達到最大值(P<0.01)；Beclin-1蛋白的表達量隨再灌注時間的延長逐漸增加于6h和12h急劇增加(P<0.01)；P62蛋白于糖氧剝奪再灌注1h時和3h無明顯變化(P>0.05)，而在再灌注6h時開始急劇增加，于12h達到最大值(P<0.01)
　　4.異丙酚改善糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)損傷的人肝L02細胞形態(tài)
　　正常培養(yǎng)的Control組和PPF組L0

10、2細胞形態(tài)正常;OGD/R組細胞廣泛空泡化，漂浮細胞明增多；較低濃度（10μmol/L，25μmol/L）異丙酚處理細胞,狀態(tài)改變不明顯；中等濃度（50μmol/L）及高濃度（100μmol/L）異丙酚處理后，細胞形態(tài)有所改善。
　　5.異丙酚改善糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)損傷的人肝L02細胞增殖活性
　　與Control組和PPF組比較，OGD/R組和OGD/R+PPF(10，25，50，100)各組的細胞相對增殖率顯著下降（P<

11、0.01），與OGD/R組比較，較低濃度（10μmol/L，25μmol/L）異丙酚處理后細胞存活率有所增加（P<0.05）；給予中等濃度（50μmol/L）異丙酚及高濃度（100μmol/L）異丙酚處理后，細胞相對增殖率顯著增加（P<0.01）。
　　6.異丙酚對糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的L02細胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1表達的影響
　　與Control組比較，OGD/R組、PPF組和各濃度異丙酚處理組自噬相關(guān)蛋白L

12、C3、Beclin-1的表達均上調(diào)（P<0.05）；與OGD/R組比較，無論是低濃度（10μmol/L，25μmol/L）還是高濃度（50μmol/L，100μmol/L）的異丙酚處理后細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的均表達下調(diào)（P<0.01）；而在低濃度（10μmol/L）異丙酚處理后，LC3蛋白無明顯變化，提高異丙酚濃度后，其表達下調(diào)（P<0.01）。
　　7.免疫熒光法檢測自噬小體的聚集
　　Control組與PPF