TonEBP信號通路在海水吸入型急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　海水淹溺是在航海、海上作業(yè)及海洋軍事行動中經(jīng)常發(fā)生的意外事故。海水吸入后，通過直接或間接作用導(dǎo)致肺部炎癥和肺水腫，如不及時控制極有可能發(fā)展成為海水吸入型急性呼吸窘迫綜合征（Seawater Inhalation Induced Acute Respiratory Distress syndrome，SW-ARDS）并最終導(dǎo)致死亡。已有的研究結(jié)果證實(shí)炎癥、肺水腫和細(xì)胞凋亡等參與 SW-ARDS的發(fā)生，但目前的研究成果

2、尚未形成針對性的理論體系，這也是SW-ARDS救治成功率未能大幅提高的主要原因。
　　與創(chuàng)傷、膿毒癥、煙霧吸入等造成的急性肺損傷相比，高滲聯(lián)合缺氧刺激是SW-ARDS的顯著特點(diǎn)。高張反應(yīng)增強(qiáng)結(jié)合蛋白（TonEBP），也稱為活性T細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-5（NFAT5），是 Rel家族的同源轉(zhuǎn)錄因子，也是哺乳動物體內(nèi)唯一已知的受滲透壓調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子。TonEBP介導(dǎo)的滲透壓調(diào)節(jié)信號通路在SW-ARDS發(fā)病中的作用如何？干預(yù)此信號通路后對SW

3、-ARDS病情的影響如何？這都是研究SW-ARDS發(fā)病機(jī)制和治療策略亟待解決的科學(xué)問題，對于闡明TonEBP介導(dǎo)的滲透壓調(diào)節(jié)通路在SW-ARDS中的關(guān)鍵作用、開創(chuàng)針對性的干預(yù)措施具有指導(dǎo)意義。
　　研究目的：
　　1.探討TonEBP信號通路在SW-ARDS大鼠和細(xì)胞模型中的表達(dá)變化；
　　2.對比配方海水、高滲NaCl溶液和LPS刺激引起細(xì)胞損傷的差異，探索針對于SW-ARDS的以TonEBP信號通路為核心的發(fā)病機(jī)制

4、；
　　3.探討TonEBP通過調(diào)節(jié)Na+, K+-ATP酶活性和表達(dá)參與調(diào)控海水刺激時肺水腫的機(jī)制。
　　研究意義：
　　本課題以海水高滲這一最顯著的特殊屬性為切入點(diǎn)，提出并驗證TonEBP信號通路是SW-ARDS發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)；相關(guān)研究明確海水刺激時肺組織中TonEBP信號通路介導(dǎo)高滲適應(yīng)、炎癥反應(yīng)和肺水腫的機(jī)制，并在一定程度上說明此信號通路的異?；罨?SW-ARDS特殊性的原因所在。為進(jìn)一步完善海水吸入型

5、肺損傷發(fā)病機(jī)制理論和開辟新的臨床治療方案提供了一種新的思路。
　　實(shí)驗方法：
　　1.動物實(shí)驗
　　健康雄性SD大鼠（180-220 g）完全隨機(jī)分為空白對照組（Control）和海水刺激1、2、4、6、8、12小時組。除空白對照組外，其它各組大鼠均按照 SW-ARDS研究慣用的方法制備動物模型，并在相應(yīng)的時間點(diǎn)取肺組織標(biāo)本。分別在大鼠吸入海水后0、1、4、6、8、12小時檢測和分析大鼠動脈血?dú)?，評價吸入海水后大鼠肺功

6、能的變化；在處死各組大鼠前30分鐘向血管內(nèi)注入伊文思藍(lán)，并在放血處死大鼠后進(jìn)行肺循環(huán)灌流，而后收集肺組織標(biāo)本檢測肺組織中伊文思藍(lán)含量，以評價肺血管通透性變化。取大鼠吸入海水0、1、4、6和12小時后肺組織標(biāo)本制備病理切片，觀察大鼠肺損傷程度；取大鼠吸入海水0、1、4、6、8、12小時后肺組織檢測肺組織中Na+, K+-ATP酶活性變化；取大鼠吸入海水0、2、4、6、8和12小時后肺臟進(jìn)行肺泡灌洗，檢測肺泡灌洗液中蛋白和細(xì)胞含量；取大鼠吸

7、入海水0、2、4、6、8和12小時后肺組織標(biāo)本，以ELISA的方法檢測肺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)量；采用Western blot的方法檢測海水刺激0、2、4、6、8和12小時后肺組織標(biāo)本中p38 MAPK、TonEBP、NF-κB、Na+, K+-ATPase-α1和Na+, K+-ATPase-β1的蛋白表達(dá)。
　　2．細(xì)胞實(shí)驗
　?。?）將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組（Control

8、）和海水刺激1、2、4、6小時組。用濃度為25％的配方海水刺激細(xì)胞并在相應(yīng)的時間點(diǎn)收集標(biāo)本，采用ELISA的方法檢測細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)量；采用Western blot的方法檢測細(xì)胞各組細(xì)胞中p38 MAPK、TonEBP、NF-κB的蛋白表達(dá)量。
　　（2）不同濃度海水刺激A549細(xì)胞：將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞分為正常對照組、5%海水組、15%海水組、25%海水組和35%海水組。不同濃度的海水刺激細(xì)

9、胞4小時后，采用Real-time PCR的方法檢測細(xì)胞中TNF-α、IκBα、MCP-1、AR、BGT1和SMIT基因表達(dá)的變化；
　?。?）不同濃度NaCl溶液干預(yù)A549細(xì)胞：用不同濃度的NaCl溶液干預(yù)處于對數(shù)生長期的A549，所用NaCl溶液的濃度分別為0（Control）、5%、10%、15%、20%和25%。不同濃度的NaCl溶液刺激細(xì)胞4小時后，采用Real-time PCR的方法檢測細(xì)胞中TNF-α、IκBα、M

10、CP-1、AR、BGT1和SMIT基因表達(dá)的變化；
　?。?）不同濃度LPS干預(yù)A549細(xì)胞：用不同濃度的LPS干預(yù)處于對數(shù)生長期的A549，干預(yù)的濃度依次為0（Control）、0.001 ng/ml、0.01 ng/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml和100 ng/ml；不同濃度LPS的培養(yǎng)基刺激細(xì)胞4小時后，采用Real-time PCR的方法檢測細(xì)胞中TNF-α、IκBα、MCP-1、AR、BGT1

11、和SMIT基因表達(dá)的變化；
　?。?）海水、NaCl溶液和LPS作用對比研究：將處于指數(shù)生長期的A549細(xì)胞分為：空白對照組（Control）、25%配方海水組（Seawater）、25% NaCl溶液組（NaCl）和10 ng/ml LPS組（LPS），上述濃度的溶液刺激海水4小時后收集細(xì)胞并提取細(xì)胞蛋白；采用Western blot的方法檢測細(xì)胞中p38 MAPK、TonEBP、NF-κB的蛋白表達(dá)量。
　?。?）海水刺

12、激導(dǎo)致細(xì)胞損傷的機(jī)制研究：用p38 MAPK抑制劑（SB203580，5μM）及TonEBP或NF-κB siRNA預(yù)處理A549細(xì)胞4小時；而后將細(xì)胞分為：空白對照組（Control）、25%配方海水組（Seawater）、25% NaCl溶液組（NaCl）和10 ng/ml LPS組（LPS）；上述溶液刺激細(xì)胞4小時，提取細(xì)胞蛋白和RNA，采用Western blot的方法檢測細(xì)胞中p38 MAPK、TonEBP、NF-κB的蛋白表

13、達(dá)量；采用Real-time PCR的方法檢測細(xì)胞中TNF-α、IκBα、MCP-1、AR、BGT1和SMIT基因表達(dá)。
　?。?）海水刺激對細(xì)胞中Na+,K+-ATP酶影響的研究：將指數(shù)生長期的A549細(xì)胞分為空白對照（Control）組、25%海水刺激2 h、4 h、6 h和8 h組；在相應(yīng)的時間點(diǎn)對細(xì)胞進(jìn)行拍照，觀察和記錄細(xì)胞形態(tài)和體積的變化；收集相應(yīng)時間點(diǎn)的細(xì)胞標(biāo)本，檢測細(xì)胞中Na+,K+-ATP酶活性的變化；提取相應(yīng)時間

14、點(diǎn)細(xì)胞蛋白檢測細(xì)胞中Na+,K+-ATPase-α1、Na+,K+-ATPase-β1及TonEBP蛋白表達(dá)的變化。此外，用TonEBP siRNA預(yù)處理A549以相同的方式干預(yù)細(xì)胞并觀察細(xì)胞中Na+, K+-ATP酶活性及蛋白表達(dá)的變化
　　實(shí)驗結(jié)果：
　?。?）海水刺激導(dǎo)致大鼠血?dú)饨Y(jié)果的惡化、肺組織結(jié)構(gòu)損傷、血管通透性增加以及肺實(shí)質(zhì)內(nèi)中性粒細(xì)胞的聚集和炎癥因子的釋放；上述變化在吸入海水后6小時最為明顯，之后逐步好轉(zhuǎn)。另外

15、，海水刺激造成肺組織中p38 MAPK信號通路的激活，同時伴有TonEBP和NF-κB及下游分子的表達(dá)。此外，體外實(shí)驗結(jié)果也證實(shí)海水的上述效應(yīng)。
　?。?）配方海水、高滲NaCl溶液和LPS刺激時都導(dǎo)致A549細(xì)胞中TNF-α、IκBα和MCP-1基因表達(dá)增高；但是相同濃度的配方海水的刺激作用強(qiáng)于高滲NaCl溶液；并且，相同濃度的配方海水對A549細(xì)胞中AR、BGT1和SMIT基因表達(dá)的促進(jìn)作用也強(qiáng)于NaCl溶液。然而，LPS刺激

16、時A549細(xì)胞中TNF-α、IκBα和MCP-1基因表達(dá)量增加，但是LPS刺激對AR、BGT1和SMIT基因的表明無明顯影響。在機(jī)制研究方面，配方海水、高滲NaCl溶液和LPS刺激均能夠促進(jìn)A549細(xì)胞p38 MAPK信號通路的異常表達(dá)；同濃度的配方海水對p38 MAPK信號通路的激活作用強(qiáng)于高滲NaCl溶液；更重要的是，同濃度的配方海水對TonEBP及其下游的滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的活化作用也明顯強(qiáng)于高滲NaCl溶液。LPS刺激導(dǎo)致A54

17、9細(xì)胞中p38 MAPK信號通路的異常表達(dá)和炎癥因子的釋放；但是，LPS刺激對TonEBP的激活作用極弱，也無法促進(jìn)其下游滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)。此外，特異性地抑制p38 MAPK信號通路時不能完全逆轉(zhuǎn)上述三種刺激對細(xì)胞的損傷作用。采用siRNA抑制TonEBP的表達(dá)后可明顯抑制配方海水與高滲NaCl對細(xì)胞的損傷作用，而對LPS的損傷效應(yīng)的影響不明顯。更為重要的是，siRNA干預(yù)TonEBPR的表達(dá)后，高滲刺激無法激活NF-κB的表達(dá)

18、；而抑制NF-κB的表達(dá)對高滲刺激時TonEBP的表達(dá)無明顯的影響，說明高滲刺激時TonEBP是NF-κB的上游調(diào)控分子。
　?。?）海水刺激增加大鼠肺組織血管的通透性，同時抑制肺組織中Na+,K+-ATP酶的活性；海水刺激致使A549細(xì)胞體積縮小，并在刺激6-8小時后造成細(xì)胞形態(tài)不可逆的變化。此外，動物和細(xì)胞實(shí)驗結(jié)果均表明，海水刺激抑制Na+,K+-ATP酶蛋白的表達(dá)可能與TonEBP的表達(dá)有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1

19、.TonEBP信號通路參與SW-ARDS的發(fā)生發(fā)展，TonEBP的表達(dá)和活化受到p38 MAPK信號通路的調(diào)節(jié)。
　　2.配方海水、高滲NaCl溶液和LPS刺激都能夠引起細(xì)胞中p38 MAPK信號通路的異常活化；配方海水和高滲NaCl溶液對TonEBP及其下游分子表達(dá)的影響更為明顯，但同比例的配方海水對TonEBP的影響強(qiáng)于高滲NaCl溶液；這說明TonEBP為核心的信號通路是SW-ARDS發(fā)病機(jī)制中的獨(dú)特環(huán)節(jié)。
　　3.T