CD47及其相關(guān)信號(hào)通路在噬血細(xì)胞綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、第一部分、不同轉(zhuǎn)染方法對人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較
　　研究目的：
　　從轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性兩方面探討不同轉(zhuǎn)染方法對siRNA轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率的影響。
　　研究方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)：用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每2-3天進(jìn)行換液、傳代。
　　2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：
　　2.1 HiperFect(R)轉(zhuǎn)染試

2、劑法：
　　取750ng siRNA與12μl Hiperfect(R)轉(zhuǎn)染試劑形成轉(zhuǎn)染混合物，作用于Jurkat細(xì)胞24h后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活率，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　2.2 InstantFECT(R)轉(zhuǎn)染試劑法：
　　根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑與siRNA不同比分3組，分別為2μl轉(zhuǎn)染試劑+30pmol siRNA、與2μl轉(zhuǎn)染試劑+60pmol siRNA和3μl轉(zhuǎn)染試劑+90pmol siRNA，將

3、形成的轉(zhuǎn)染混合物作用于Jurkat細(xì)胞24h后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活率，熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　3. NucleofectionTM(R)電轉(zhuǎn)法
　　不同程序（CL-120、CM-137、CM-158、CM-189、CU-150和DG-150）刺激Jurkat細(xì)胞24h后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞存活率，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　結(jié)果:
　　1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中，HiperFect(R)轉(zhuǎn)染試

4、劑法和InstantFECT(R)轉(zhuǎn)染試劑法的細(xì)胞活性分別為（0.90±0.029）和（0.91±0.025），NucleofectionTM電轉(zhuǎn)法中CL-120、CM-137、CM-158、CM-189、CU-150和DG-150程序下細(xì)胞活性分別為（0.87±0.018）、（0.22±0.29）、（0.35±0.04）、（0.31±0.015）、（0.57±0.025）和（0.32±0.02）。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的兩種方法以及電轉(zhuǎn)中CL-1

5、20程序下，該3組間兩兩比較細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中，HiperFect(R)轉(zhuǎn)染試劑法和InstantFECT(R)轉(zhuǎn)染試劑法的轉(zhuǎn)染效率分別為（0.22±0.04）和（0.17±0.05），NucleofectionTM電轉(zhuǎn)法中CL-120、CM-137、CM-158、CM-189、CU-150和DG-150程序下轉(zhuǎn)染效率分別為（0.82±0.008）、（0.32±0.02）、（0.09±

6、0.04）、（0.15±0.025）、（0.75±0.057）和（0.33±0.028）。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的兩種方法以及電轉(zhuǎn)中CL-120程序下，該3組間兩兩比較轉(zhuǎn)染效率差異有顯著性意義（P＜0.05）
　　結(jié)論:
　　從轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性兩方面進(jìn)行評(píng)估，NucleofectionTM(R)電轉(zhuǎn)法中的CL-120程序是一種轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞的新的安全，有效的轉(zhuǎn)染方法。
　　第二部分、CD47在噬血細(xì)胞綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用

7、研究
　　研究內(nèi)容:
　　選用Jurkat細(xì)胞株和HLH患兒骨髓來源的巨噬細(xì)胞為研究對象。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，改變細(xì)胞CD47的表達(dá)水平，觀察CD47的不同表達(dá)水平對巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響。
　　研究方法:
　　1.骨髓來源巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)：從HLH患兒骨髓中提取單個(gè)核細(xì)胞，以M-CSF誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，待巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功后，予IFN-γ和LPS刺激巨噬細(xì)胞向M1型分化，采用顯微

8、鏡下形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測M1型巨噬細(xì)胞是否培養(yǎng)成功。
　　2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染法：詳見第一部分Nucleofection(R)電轉(zhuǎn)法中CL-120程序。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)：
　　3.1 骨髓巨噬細(xì)胞培養(yǎng)鑒定，取不同時(shí)間（第5天，第8天）培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，用CD11b-APC、CD14-FITC和F4/80-PE標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)鑒定巨噬細(xì)胞分化情況。
　　3.2 取不同CD47 siRNA轉(zhuǎn)染72h后得Ju

9、rkat細(xì)胞，CD47-FITC標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞膜表面CD47的表達(dá)情況。
　　4.U937細(xì)胞的活化：取2×104個(gè)U937細(xì)胞，并用20ng/ml IFN-γ和10ng/ml LPS刺激48h，用PBS洗3次后，備用；
　　5.細(xì)胞體外吞噬功能的檢測：
　　取不同CD47表達(dá)情況的Jurkat細(xì)胞與活化的U937細(xì)胞或HLH患兒骨髓培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)2h，瑞士吉姆薩染色法檢測細(xì)胞吞噬率，吞噬率＝（

10、200個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬Jurkat細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)／200個(gè)巨噬細(xì)胞）×100％。
　　結(jié)果:
　　1.巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成功的鑒別方法：形態(tài)學(xué)方面，骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)M-CSF誘導(dǎo)后第7天出現(xiàn)了巨噬細(xì)胞的典型形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后有（91.4±4.7）%細(xì)胞表達(dá)CD11b和F4/80；用20ng/ml IFN-γ和10ng/ml LPS刺激培養(yǎng)成功的巨噬細(xì)胞48h，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈現(xiàn)長

11、梭形，偽足較細(xì)長，為M1型巨噬細(xì)胞的典型形態(tài)，說明巨噬細(xì)胞培養(yǎng)成功。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)比較轉(zhuǎn)染不同si-CD4724h、48h、72h后細(xì)胞膜CD47表達(dá)，結(jié)果顯示以si-CD47-3的抑制效果最好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；比較轉(zhuǎn)染后24h、48h以及72h的CD47表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)以轉(zhuǎn)染后48h抑制效果最佳，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；
　　3.以活化的U937細(xì)胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)si-CD47-1、si-

12、CD47-2和si-CD47-3組巨噬細(xì)胞的吞噬率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05））。將CD47的表達(dá)水平與細(xì)胞吞噬率做相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) CD47表達(dá)水平與吞噬率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.925，p=0.001）
　　4.以HLH患兒和急性白血?。ˋL）患兒骨髓來源的巨噬細(xì)胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上CD47的表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞的吞噬作用成反比，即CD47的表達(dá)越低，巨噬細(xì)胞的吞噬作用越明顯，并且與巨噬細(xì)胞的來源無關(guān)。在同一水平表達(dá)的的

13、CD47，與對照組白血病患兒相比，HLH患兒骨髓來源的巨噬細(xì)胞的吞噬率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞體系；
　　2.不同位點(diǎn)的siRNA對CD47基因的抑制作用不同，以si-CD47-3的抑制效果最好；在轉(zhuǎn)染CD47siRNA不同時(shí)間中，以轉(zhuǎn)染后48h抑制效果最佳；
　　3.以活化的U937細(xì)胞和HLH患兒骨髓來源的巨噬細(xì)胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)CD47的表達(dá)水平與細(xì)胞吞噬率呈負(fù)相關(guān)，與

14、巨噬細(xì)胞的來源無關(guān)。
　　第三部分、噬血細(xì)胞綜合征臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)分析
　　研究內(nèi)容:
　　選用臨床資料作為研究對象，探討HLH相關(guān)臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化特點(diǎn)，評(píng)估HLH的早期診斷指標(biāo)以及預(yù)后不良因素。
　　研究方法:
　　采用回顧分析法對比分析好轉(zhuǎn)病例、死亡病例的臨床、實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)及治療因素。
　　結(jié)果:
　　1.將19例HLH患兒中分為好轉(zhuǎn)組8例和死亡組11例，兩組之間的熱程、熱峰、淋巴

15、結(jié)腫大以及肝脾腫大的大小無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；
　　2.實(shí)驗(yàn)室檢查：比較死亡組與好轉(zhuǎn)組之間的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查，發(fā)現(xiàn)血象降低程度（P=0.033）、凝血功能異常（P=0.020）以及凝血酶原時(shí)間（PT）異常（P=0.001）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；異型淋巴細(xì)胞；活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT）、LDH、ALT、AST、IgG、IgA、IgM和β2微球蛋白、SF水平、EBV-DNA負(fù)載量、EBV抗體譜以及骨髓中找到噬血細(xì)胞在兩組之間無統(tǒng)計(jì)

16、學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3. SF動(dòng)態(tài)變化：8例好轉(zhuǎn)HLH患兒隨著病情緩解，SF也隨之下降，11例死亡患兒中10例患兒隨病情進(jìn)展，SF隨之升高，其中1例患兒隨病情進(jìn)展SF下降，該患兒發(fā)病以神經(jīng)系統(tǒng)受累為首發(fā)癥狀。
　　4.將19例HLH患兒與52例傳染性單核細(xì)胞增多癥和重癥感染患兒用非參數(shù)假設(shè)下ROC曲線評(píng)價(jià)SF診斷HLH。SF的AUC為0.931，其中SF＞10000.00μg/L時(shí)，敏感度為22.22%，特異度為1

17、00.00%，SF＞3000.00μg/L時(shí)，敏感度為38.9%，特異度為100%，SF＞1000.00μg/L時(shí)，敏感度為83.33%，特異度為83.00%，SF＞500.00μg/L時(shí)，敏感度為100.00%，特異度為73.40%。
　　結(jié)論:
　　1.血象降低的程度、纖維蛋白原降低的程度以及PT水平升高可能與預(yù)后不良有關(guān)。
　　2.SF＞3000μg/L時(shí)，可作為初步診斷HLH的可靠指標(biāo)。
　　3.血清SF