CD47及其相關(guān)信號通路在噬血細胞綜合征發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、第一部分、不同轉(zhuǎn)染方法對人T淋巴細胞白血病細胞Jurkat細胞轉(zhuǎn)染效率的比較
　　研究目的：
　　從轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性兩方面探討不同轉(zhuǎn)染方法對siRNA轉(zhuǎn)染Jurkat細胞的轉(zhuǎn)染效率的影響。
　　研究方法:
　　1.細胞培養(yǎng)：用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Jurkat細胞，根據(jù)細胞生長情況，每2-3天進行換液、傳代。
　　2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：
　　2.1 HiperFect(R)轉(zhuǎn)染試

2、劑法：
　　取750ng siRNA與12μl Hiperfect(R)轉(zhuǎn)染試劑形成轉(zhuǎn)染混合物，作用于Jurkat細胞24h后，用臺盼藍染色法檢測細胞存活率，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　2.2 InstantFECT(R)轉(zhuǎn)染試劑法：
　　根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑與siRNA不同比分3組，分別為2μl轉(zhuǎn)染試劑+30pmol siRNA、與2μl轉(zhuǎn)染試劑+60pmol siRNA和3μl轉(zhuǎn)染試劑+90pmol siRNA，將

3、形成的轉(zhuǎn)染混合物作用于Jurkat細胞24h后，用臺盼藍染色法檢測細胞存活率，熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　3. NucleofectionTM(R)電轉(zhuǎn)法
　　不同程序（CL-120、CM-137、CM-158、CM-189、CU-150和DG-150）刺激Jurkat細胞24h后，用臺盼藍染色法檢測細胞存活率，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　結(jié)果:
　　1.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中，HiperFect(R)轉(zhuǎn)染試

4、劑法和InstantFECT(R)轉(zhuǎn)染試劑法的細胞活性分別為（0.90±0.029）和（0.91±0.025），NucleofectionTM電轉(zhuǎn)法中CL-120、CM-137、CM-158、CM-189、CU-150和DG-150程序下細胞活性分別為（0.87±0.018）、（0.22±0.29）、（0.35±0.04）、（0.31±0.015）、（0.57±0.025）和（0.32±0.02）。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的兩種方法以及電轉(zhuǎn)中CL-1

5、20程序下，該3組間兩兩比較細胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中，HiperFect(R)轉(zhuǎn)染試劑法和InstantFECT(R)轉(zhuǎn)染試劑法的轉(zhuǎn)染效率分別為（0.22±0.04）和（0.17±0.05），NucleofectionTM電轉(zhuǎn)法中CL-120、CM-137、CM-158、CM-189、CU-150和DG-150程序下轉(zhuǎn)染效率分別為（0.82±0.008）、（0.32±0.02）、（0.09±

6、0.04）、（0.15±0.025）、（0.75±0.057）和（0.33±0.028）。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的兩種方法以及電轉(zhuǎn)中CL-120程序下，該3組間兩兩比較轉(zhuǎn)染效率差異有顯著性意義（P＜0.05）
　　結(jié)論:
　　從轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性兩方面進行評估，NucleofectionTM(R)電轉(zhuǎn)法中的CL-120程序是一種轉(zhuǎn)染Jurkat細胞的新的安全，有效的轉(zhuǎn)染方法。
　　第二部分、CD47在噬血細胞綜合征發(fā)病機制中的作用

7、研究
　　研究內(nèi)容:
　　選用Jurkat細胞株和HLH患兒骨髓來源的巨噬細胞為研究對象。利用細胞轉(zhuǎn)染、流式細胞術(shù)等實驗技術(shù)手段，改變細胞CD47的表達水平，觀察CD47的不同表達水平對巨噬細胞吞噬作用的影響。
　　研究方法:
　　1.骨髓來源巨噬細胞的體外培養(yǎng)：從HLH患兒骨髓中提取單個核細胞，以M-CSF誘導(dǎo)單個核細胞向巨噬細胞分化，待巨噬細胞誘導(dǎo)成功后，予IFN-γ和LPS刺激巨噬細胞向M1型分化，采用顯微

8、鏡下形態(tài)學(xué)觀察、流式細胞術(shù)等方法檢測M1型巨噬細胞是否培養(yǎng)成功。
　　2.細胞轉(zhuǎn)染法：詳見第一部分Nucleofection(R)電轉(zhuǎn)法中CL-120程序。
　　3.流式細胞術(shù)：
　　3.1 骨髓巨噬細胞培養(yǎng)鑒定，取不同時間（第5天，第8天）培養(yǎng)的巨噬細胞，用CD11b-APC、CD14-FITC和F4/80-PE標記細胞，流式細胞術(shù)鑒定巨噬細胞分化情況。
　　3.2 取不同CD47 siRNA轉(zhuǎn)染72h后得Ju

9、rkat細胞，CD47-FITC標記細胞，流式細胞術(shù)檢測各組細胞膜表面CD47的表達情況。
　　4.U937細胞的活化：取2×104個U937細胞，并用20ng/ml IFN-γ和10ng/ml LPS刺激48h，用PBS洗3次后，備用；
　　5.細胞體外吞噬功能的檢測：
　　取不同CD47表達情況的Jurkat細胞與活化的U937細胞或HLH患兒骨髓培養(yǎng)的巨噬細胞共培養(yǎng)2h，瑞士吉姆薩染色法檢測細胞吞噬率，吞噬率＝（

10、200個巨噬細胞中吞噬Jurkat細胞的巨噬細胞數(shù)／200個巨噬細胞）×100％。
　　結(jié)果:
　　1.巨噬細胞培養(yǎng)成功的鑒別方法：形態(tài)學(xué)方面，骨髓來源的單個核細胞經(jīng)M-CSF誘導(dǎo)后第7天出現(xiàn)了巨噬細胞的典型形態(tài)；流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)骨髓來源的單個核細胞經(jīng)誘導(dǎo)后有（91.4±4.7）%細胞表達CD11b和F4/80；用20ng/ml IFN-γ和10ng/ml LPS刺激培養(yǎng)成功的巨噬細胞48h，光鏡下觀察細胞形態(tài)，細胞呈現(xiàn)長

11、梭形，偽足較細長，為M1型巨噬細胞的典型形態(tài)，說明巨噬細胞培養(yǎng)成功。
　　2.流式細胞術(shù)比較轉(zhuǎn)染不同si-CD4724h、48h、72h后細胞膜CD47表達，結(jié)果顯示以si-CD47-3的抑制效果最好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；比較轉(zhuǎn)染后24h、48h以及72h的CD47表達情況，發(fā)現(xiàn)以轉(zhuǎn)染后48h抑制效果最佳，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；
　　3.以活化的U937細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)si-CD47-1、si-

12、CD47-2和si-CD47-3組巨噬細胞的吞噬率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05））。將CD47的表達水平與細胞吞噬率做相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) CD47表達水平與吞噬率呈負相關(guān)（r=-0.925，p=0.001）
　　4.以HLH患兒和急性白血?。ˋL）患兒骨髓來源的巨噬細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)細胞膜上CD47的表達水平與巨噬細胞的吞噬作用成反比，即CD47的表達越低，巨噬細胞的吞噬作用越明顯，并且與巨噬細胞的來源無關(guān)。在同一水平表達的的

13、CD47，與對照組白血病患兒相比，HLH患兒骨髓來源的巨噬細胞的吞噬率無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)巨噬細胞體系；
　　2.不同位點的siRNA對CD47基因的抑制作用不同，以si-CD47-3的抑制效果最好；在轉(zhuǎn)染CD47siRNA不同時間中，以轉(zhuǎn)染后48h抑制效果最佳；
　　3.以活化的U937細胞和HLH患兒骨髓來源的巨噬細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)CD47的表達水平與細胞吞噬率呈負相關(guān)，與

14、巨噬細胞的來源無關(guān)。
　　第三部分、噬血細胞綜合征臨床及實驗室檢查特點分析
　　研究內(nèi)容:
　　選用臨床資料作為研究對象，探討HLH相關(guān)臨床表現(xiàn)和實驗室指標變化特點，評估HLH的早期診斷指標以及預(yù)后不良因素。
　　研究方法:
　　采用回顧分析法對比分析好轉(zhuǎn)病例、死亡病例的臨床、實驗室特點及治療因素。
　　結(jié)果:
　　1.將19例HLH患兒中分為好轉(zhuǎn)組8例和死亡組11例，兩組之間的熱程、熱峰、淋巴

15、結(jié)腫大以及肝脾腫大的大小無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；
　　2.實驗室檢查：比較死亡組與好轉(zhuǎn)組之間的各項實驗室檢查，發(fā)現(xiàn)血象降低程度（P=0.033）、凝血功能異常（P=0.020）以及凝血酶原時間（PT）異常（P=0.001）有統(tǒng)計學(xué)意義；異型淋巴細胞；活化部分凝血活酶時間(APTT）、LDH、ALT、AST、IgG、IgA、IgM和β2微球蛋白、SF水平、EBV-DNA負載量、EBV抗體譜以及骨髓中找到噬血細胞在兩組之間無統(tǒng)計

16、學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3. SF動態(tài)變化：8例好轉(zhuǎn)HLH患兒隨著病情緩解，SF也隨之下降，11例死亡患兒中10例患兒隨病情進展，SF隨之升高，其中1例患兒隨病情進展SF下降，該患兒發(fā)病以神經(jīng)系統(tǒng)受累為首發(fā)癥狀。
　　4.將19例HLH患兒與52例傳染性單核細胞增多癥和重癥感染患兒用非參數(shù)假設(shè)下ROC曲線評價SF診斷HLH。SF的AUC為0.931，其中SF＞10000.00μg/L時，敏感度為22.22%，特異度為1

17、00.00%，SF＞3000.00μg/L時，敏感度為38.9%，特異度為100%，SF＞1000.00μg/L時，敏感度為83.33%，特異度為83.00%，SF＞500.00μg/L時，敏感度為100.00%，特異度為73.40%。
　　結(jié)論:
　　1.血象降低的程度、纖維蛋白原降低的程度以及PT水平升高可能與預(yù)后不良有關(guān)。
　　2.SF＞3000μg/L時，可作為初步診斷HLH的可靠指標。
　　3.血清SF