以LOV2結(jié)構(gòu)域?yàn)榛A(chǔ)的熒光探針的設(shè)計(jì)及膽綠素與DNA相互作用的研究.pdf

1、燕麥向光素的LOV(Light，Oxygen，Voltage)結(jié)構(gòu)域包含LOV1和LOV2兩個(gè)亞基。其中LOV2結(jié)構(gòu)域作為熒光蛋白，相比于綠色熒光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)，具有自身獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):1、LOV2結(jié)構(gòu)域蛋白是可溶性的;2、它的相對(duì)分子質(zhì)量小，大約只有100-140個(gè)氨基酸殘基;3、它的光吸收輔助因子-黃素單核甘酸(flavin mononucleotide，F(xiàn)MN)幾乎存在于所有類型的細(xì)胞

2、中;4、相同條件下，其熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于綠色熒光蛋白。正是由于這些優(yōu)點(diǎn)使其成為了光遺傳學(xué)研究的理想工具，廣泛地被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的研究中。
　　本論文主要包括以下三個(gè)部分的工作:
　　1.本研究根據(jù)Genebank中的燕麥向光素基因序列，人工合成了LOV2結(jié)構(gòu)域編碼的基因片段:AsLOV2(404-560);并構(gòu)建C450A突變基因，AsLOV2(404-560，C450A);進(jìn)一步缺失C末端的Jα肽段，得到AsLOV2(

3、404-521，C450A)。這三個(gè)基因片段被克隆于表達(dá)載體pGEX-6p-1，利用親和層析的方法，純化得到與gst標(biāo)簽融合的目標(biāo)蛋白。結(jié)果表明三種純化蛋白具有與參考文獻(xiàn)一致的吸收光譜，且三種蛋白均可與FMN結(jié)合，并表現(xiàn)出光活性。在熒光強(qiáng)度方面，突變蛋白的熒光強(qiáng)度大約是野生型的6倍，突變截短型蛋白的熒光強(qiáng)度大約是野生型的7倍。在此前提下，本研究還構(gòu)建表達(dá)了AsLOV2(404-521，C450A)與細(xì)胞色素b562(cytochrome

4、 b562, cytb562)的融合蛋白，即cytb562-3c-AsLOV2(404-521，C450A)和AsLOV2(404-521，C450A)-3c-cytb562。3c蛋白酶(PreScission protease)具有特異性識(shí)別融合蛋白連接肽段的作用，用其對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切。結(jié)果表明:聚丙烯酰胺凝膠電泳圖顯示融合蛋白被3c蛋白酶切割開，但是融合蛋白的熒光強(qiáng)度并未如預(yù)期的那樣顯著增強(qiáng)。
　　2.本研究還將野生型AsL

5、OV2結(jié)構(gòu)域中半胱氨酸周圍的一些氨基酸均突變?yōu)榘腚装彼幔?gòu)建了N449C、R451C、Q446C、I428C、F429C、A430C等突變。在有Hg2+存在的條件下，野生型AsLOV2中的半胱氨酸巰基與Hg2+結(jié)合而不與FMN發(fā)生加成反應(yīng)，從而使熒光增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的熒光檢測(cè)。結(jié)果表明:這些突變蛋白和野生型一樣，均未實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+有明顯熒光增強(qiáng)的響應(yīng)效應(yīng)，其中F429C突變蛋白加入Hg2+后，熒光強(qiáng)度略有升高。
　　3.本論