腫瘤抑制蛋白p53DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶基因相互作用的研究.pdf

1、腫瘤抑制蛋白p53是一個廣泛分布的磷蛋白,其具備維持基因組完整的功能。野生型的p53主要由三個功能結(jié)構(gòu)域組成:C端四聚化結(jié)構(gòu)域、N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和一個中心DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(p53DBD),其包含96-308氨基酸。P53被細(xì)胞壓力激活以后,作為一個轉(zhuǎn)錄因子進一步激活下游基因,參與包括細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、血管形成抑制、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程。所有這些已知的生物學(xué)功能都依賴于其DNA結(jié)合特性。野生型的p53通過序列特異性

2、的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(p53DBD)結(jié)合DNA。P53基因在50％的腫瘤當(dāng)中發(fā)生突變,而這些突變主要發(fā)生在序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,突變的p53不能激活下游基因轉(zhuǎn)錄。因此,序列特異性的DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活活性是p53最關(guān)鍵的生物學(xué)功能。
　　 p53DBD的晶體結(jié)構(gòu)表明:p53核心結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)為:一個β-三明治結(jié)構(gòu)形成腳手架,支撐兩個大環(huán)和一個環(huán)-片層-螺旋模序。p53DBD上的三個半胱氨酸(Cys176、Cys238和Cys2

3、42)和一個組氨酸(His179)結(jié)合一個鋅離子。鋅離子的結(jié)合被認(rèn)為是p53轉(zhuǎn)錄激活所必需的,去除鋅離子將會使p53DBD降低DNA結(jié)合特異性。不過,鎘離子、汞離子和銅離子結(jié)合p53蛋白,卻導(dǎo)致p53構(gòu)象和DNA結(jié)合活性的破壞。不同金屬離子對p53DBD蛋白截然相反的作用可以預(yù)計:存在其他的金屬離子或細(xì)胞因子能夠結(jié)合并影響p53DBD。
　　 在本論文中,我們利用熒光滴定法研究了9種金屬離子與p53DBD的結(jié)合反應(yīng),其結(jié)合能力依

4、次為Fe3+＞Zn2+＞Cu2+＞Ca2+＞Mg2+＞Ba2+＞Mn2+＞Ni2+＞Co2+。圓二色譜研究結(jié)果表明,Ba2+、Ca2+、Co2+、Mn2+、Ni2+這些離子并未引起蛋白二級結(jié)構(gòu)變化,Zn2+、Mg2+、Fe3+這三種離子誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)細(xì)微調(diào)整,而Cu2+離子結(jié)合導(dǎo)致蛋白螺旋結(jié)構(gòu)大量丟失。ANS結(jié)合研究結(jié)果表明,Mg2+與Zn2+相似,誘導(dǎo)p53DBD蛋白表面疏水性增強,而Fe3+引起p53DBD蛋白表面疏水性降低。因此,M

5、g2+和Fe3+可能是潛在的影響或調(diào)節(jié)p53活性的因子之一。
　　 接著,我們研究了Mg2+對p53DBD與DNA結(jié)合的影響。競爭結(jié)合分析表明鎂離子與鋅離子競爭結(jié)合p53DBD。圓二色譜分析表明鎂離子結(jié)合誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生細(xì)微的改變而不是激烈的變化?；陔娪具w移分析和熒光分析實驗,我們推斷:Mg2+以一種非序列特異性的方式刺激p53DBD蛋白結(jié)合DNA,這與Zn2+特異性的方式不同?；诩?xì)胞內(nèi)鎂離子濃度相對較高并且能夠影響胞內(nèi)酶的

6、活性的事實,我們認(rèn)為:鎂離子是潛在的影響或調(diào)節(jié)p53轉(zhuǎn)錄激活活性的因子之一。
　　 金屬離子對p53DBD結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性影響研究表明:金屬離子結(jié)合能增加p53DBD的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。分析丙烯酰胺淬滅實驗表明:金屬離子結(jié)合p53DBD誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,并且這種變化給蛋白提供一個保護作用,防止丙烯酰胺淬滅。綜合起來,我們認(rèn)為:p53DBD作為一個轉(zhuǎn)錄因子起作用的過程中,金屬離子起到雙重調(diào)節(jié)作用。金屬離子不僅支持DNA結(jié)合活性,