ATR-TEM8 vWA結構域與PA的相互作用.pdf

1、炭疽毒素是炭疽芽孢桿菌Bacillus anthracis的主要毒力因子，包括三個組分：保護性抗原PA，致死因子LF，水腫因子EF。目前發(fā)現(xiàn)兩種炭疽毒素受體：腫瘤內皮細胞標志抗原8(TEM8)和毛細血管生成蛋白2(CMG2)。這兩個受體在其胞外區(qū)都具有vWA結構域，其中60％的序列保守。抑制PA與受體的結合可有效地阻斷炭疽毒素。炭疽病發(fā)展到晚期，在毒素大量釋放后單靠抗生素治療達不到效果，此時毒素抑制劑顯得尢為重要。受體類抑制物，比如哺乳

2、動物細胞表達的CMG2 vWA結構域已被用于炭疽抗毒劑的研究。
　　 本工作通過X射線衍射解析了高分辨率(1.7A)的ATR/TEM8vWA結構域晶體結構。結構顯示1個晶格中包括6個TEM8vWA結構域分子。在這個六聚體中，配基結合的MIDAS序列位點被鄰近的單體所封閉，顯示此六聚體分子沒有活性。另外，凝膠過濾層析以及超速離心沉降實驗表明溶液中TEM8以單體存在。這樣，觀察到的六聚體形式可能是由于晶體堆積造成的假象。
　　

3、 TEM8的晶體結構與CMG2的vWA結構域高度相似，同樣以經(jīng)典的α/β開放式片層折疊結構（又名二核苷結合折疊，或Ros smann折疊，或雙重纏繞折疊）存在。值得注意的是有一個乙酸根離子與CMG2結構中的類似離子以同樣的方式模仿PA的D683側鏈占據(jù)MIDAS位點。此乙酸根離子，以及S52，S54，Tl18和兩個水分子與Mg2+進行螯合，表明解析的TEM8具有Mg2+螯合的保守的MIDAS基序，且以開放構象存在，
　　 以此

4、結構以及PA-CMG2復合物晶體結構(PDB1T6B)，通過疊合和分子替換構建了PA-TEM8復合物的結構模型。經(jīng)過溶劑化和能量優(yōu)化，得到了PA分別與兩種受體在溶液中的復合物結構模型。通過分析和比較，模型顯示PA與兩種受體間的相互作用在以下幾處高度保守：PA D683，N682與受體的MDAS基序S52，S54，T118的相互作用；以及受體Y119，K51與PA的相互作用。在56，88，113，115，156（按TEM8序列）處兩模型有

5、明顯的不一樣，顯示可能受體與PA的結合在這些地方有所差異。
　　 對TEM8上同源于PA-CMG2結合界面上的CMG2相關殘基進行同源掃描替換，經(jīng)大腸桿菌表達和對可溶組分的純化，得到的突變體在J774A.1細胞上檢測了其炭疽致死毒素攻擊的保護活性。L56A突變體活性增強到野生型的4倍，而E155G增強不到一倍，L56A與E155G的聯(lián)合突變體增強了大概6倍的活性。與之對比，H57N，R88Q，L157V,F158P等點突變的保護

6、活性均有下降。用表面等離子共振技術檢測了這些突變體與PA的親和力，其變化趨勢與細胞實驗的結果一致。
　　 同時以抗SDS的孔道復合物形成實驗檢測了這些突變對PA從前孔復合物至到孔道復合物進行構象轉變所需pH閾值的影響，所有單突變都沒有明顯的改變，而154-158的聯(lián)合突變體對比野生型顯示出了明顯的區(qū)別，接近CMG2。
　　 另外，本工作為毒素中和的細胞實驗和基于受體類抑制劑的Schlid plot實驗推導了一個數(shù)學模型。

7、此數(shù)學模型將細胞實驗的結果與受體與PA結合的動力學參數(shù)關聯(lián)起來。運用此模型評價了TEM8突變體的L56A及E155G+L56A的親和力，同時SPR的結果與此模型基本一致。
　　 最后，以大鼠模型評價了TEM8以及其突變體L56A作為抗毒劑對炭疽致死毒素的體內中和活性。不同于前人報道，TEM8顯示出良好表現(xiàn)，在7.5:1-3:1的摩爾比（受體：PA）能完全保護動物。而CMG2的保護活性較一致，為3:1左右。L56A能在3：1到1:

8、1之間完全保護動物，表現(xiàn)優(yōu)于CMG2，盡管其KD及細胞上的保護活性都低與CMG2，這可能是因為在體內存在其他配基能與CMG2作用而不結合TEM8或是其突變體，這樣，CMG2作為抗毒劑就有可能導致副作用，此假設仍需要實驗驗證。
　　 在此工作中，TEM8 vWA結構域高分辨率晶體結構的獲得，以及溶液中兩種受體復合物模型的構建，為進一步的分子動力學模擬研究溶液中構象的轉變及分子行為以提供更多關于PA受體相互作用的細節(jié)奠定了基礎，而且

9、有助于蛋白設計以獲得更高親和力的受體突變體及選擇性結合TEM8以作為腫瘤靶向載體的PA突變體。同時，證明了兩種受體在56，88，155位點處與PA的相互作用存在差異，在56和155處的單位點或是聯(lián)合的同源替換突變能增強TEM8的結合力，而R88Q突變削弱了TEM8的親和力。這些發(fā)現(xiàn)為設計更有效的受體類抑制劑提供了研究靶點。進一步的，本工作推導的數(shù)學模型將細胞實驗結果與受體的解離常數(shù)KD相關聯(lián)，減少了由于不同批次間鋪板細胞數(shù)及受體表達情況