BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的影響.pdf

1、【背景】
　　1.多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）的特性：多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是一種工業(yè)的化學(xué)物，也是一種環(huán)境污染物，常作為阻燃劑用于建筑材料、電子產(chǎn)品及紡織品中。我國(guó)作為塑料制品、紡織品、電路板生產(chǎn)加工的大國(guó)，生產(chǎn)、使用居世界首位,在我國(guó)一些地區(qū)已形成了電子垃圾拆解集散地,使PBDEs等持久性有毒污染物不斷向周?chē)尫?嚴(yán)重污染了當(dāng)?shù)丨h(huán)境,危害人體健康。
　　由于PBDEs能夠通過(guò)食物鏈轉(zhuǎn)移，有生物放大效應(yīng)，進(jìn)而影響人體健康。研

2、究表明，環(huán)境中的多溴聯(lián)苯醚正不斷以指數(shù)形式增長(zhǎng),PBDEs在環(huán)境中穩(wěn)定性好,可在水體、土壤和底泥等環(huán)境介質(zhì)中存留數(shù)年,也可沿著食物鏈傳播,最終經(jīng)大氣、室塵、食物、母乳等蓄積于人體內(nèi)。眾多研究發(fā)現(xiàn)多溴聯(lián)苯醚的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)包括對(duì)生物體內(nèi)酶系統(tǒng)活力的影響；對(duì)生物體生殖系統(tǒng)、甲狀腺、神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)的影響；可能有致畸、致癌和致突變作用，因此，在一些發(fā)達(dá)國(guó)家，低溴類(lèi)如BDE-47,99,153等已限制生產(chǎn)和使用，但高溴類(lèi)PBDEs如BDE-

3、208，BDE-209等因阻燃性能好，成本低而仍在廣泛使用。我國(guó)廣東珠三角地區(qū)PBDEs主要類(lèi)型是十溴聯(lián)苯醚。
　　2.十溴聯(lián)苯醚(BDE-209)的特性：十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）是我國(guó)使用量最大的一種溴代阻燃劑，主要用于與人們?nèi)粘Ｉ钪苯酉嚓P(guān)的各種產(chǎn)品中，如家用電器、塑料、布料等易燃物品中。由于用量較大，BDE-209環(huán)境污染的持續(xù)增加導(dǎo)致其成為我國(guó)人群中最主要的多溴聯(lián)苯醚暴露類(lèi)型，在人類(lèi)的精液、臍血以及胎盤(pán)中均檢測(cè)到了BD

4、E-209，證實(shí)了BDE-209圍產(chǎn)期暴露的嚴(yán)峻現(xiàn)狀。由于神經(jīng)發(fā)育毒性可導(dǎo)致學(xué)習(xí)與記憶力障礙，妊娠期 BDE-209暴露后大鼠子代的腦組織中可以檢測(cè)到BDE-209，證實(shí)圍產(chǎn)期BDE-209暴露可以直接作用于子代的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期BDE-209暴露后，其子代學(xué)習(xí)及記憶能力顯著地下降。人類(lèi)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)出生前和哺乳期BDE-209暴露與嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育尤其是學(xué)習(xí)與記憶能力發(fā)育呈負(fù)相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，BDE-209暴露

5、可以引起神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力下降、凋亡增加，可以影響神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，揭示了BDE-209的急性神經(jīng)毒性的初步機(jī)制，但并不能充分解釋圍產(chǎn)期BDE-209暴露可導(dǎo)致子代成年后學(xué)習(xí)記憶能力下降這種遠(yuǎn)期效應(yīng)的產(chǎn)生，所以研究BDE-209的作用機(jī)制，確定作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可以為進(jìn)一步闡明BDE-209宮內(nèi)暴露對(duì)胎兒的神經(jīng)發(fā)育毒性提供新研究思路，為國(guó)家制定相關(guān)政策提供理論依據(jù)。
　　3.神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分化的表觀遺傳調(diào)控：過(guò)去研究已經(jīng)證實(shí)

6、，大腦中重要結(jié)構(gòu)海馬與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切。而在胚胎期直至成年大腦中一直存在的神經(jīng)干細(xì)胞為學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的研究提供了一個(gè)新的視點(diǎn)。哺乳動(dòng)物胚胎期，神經(jīng)干細(xì)胞主要分布于海馬、紋狀體、大腦皮質(zhì)、中腦等區(qū)域。哺乳動(dòng)物腦內(nèi)在側(cè)腦室室管膜下區(qū)(SVZ)和海馬齒狀回顆粒下區(qū)(SGZ)兩個(gè)部位終生存在神經(jīng)干細(xì)胞，這些 NSC可增殖分裂產(chǎn)生新的神經(jīng)元，并整合到局部神經(jīng)環(huán)路中，參與學(xué)習(xí)記憶過(guò)程。在大腦發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)干細(xì)胞可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，但是分子機(jī)制

7、尚未完全清楚。越來(lái)越多的研究表明,神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力與其表觀遺傳修飾狀態(tài)有關(guān)。作為重要的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象之一,DNA的甲基化對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控的形成起著重要的作用。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmt）可催化和維持DNA甲基化過(guò)程。最新的研究表明氧化應(yīng)激參與了基因組DNA甲基化水平的調(diào)控。氧化應(yīng)激可以引起細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（ROS）水平的升高以及激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖凋亡等多種生物學(xué)行為。已有研究顯示氧化應(yīng)激水

8、平增加與 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)，參與DNA甲基化的調(diào)控，從而參與神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力的調(diào)控，DNA甲基化水平的降低可以改變神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力。環(huán)境因素可以影響暴露細(xì)胞的DNA的甲基化狀態(tài)。有機(jī)氯農(nóng)藥、甲基汞等可以降低肝細(xì)胞的DNA甲基化程度。
　　前期研究發(fā)現(xiàn)孕期BDE-209暴露會(huì)降低子鼠海馬NSCs分化能力，使NSC向神經(jīng)元的分化能力下降，而向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化增加；這個(gè)發(fā)現(xiàn)提示我們神經(jīng)干細(xì)胞分化能

9、力可能是BDE-209神經(jīng)毒性的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。膽堿能神經(jīng)元在記憶、認(rèn)知功能以及海馬神經(jīng)發(fā)生方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)BDE-209圍產(chǎn)期暴露后，子代大鼠海馬組織乙酰膽堿脂酶及乙酰膽堿活性明顯下降。Johansson等發(fā)現(xiàn)BDE-209新生期暴露可引起成年小鼠膽堿能受體下調(diào),膽堿能敏感性下降并隨著年齡惡化。由此可見(jiàn),BDE-209可以影響神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力尤其是向膽堿能神經(jīng)元分化的能力可能是其影響學(xué)習(xí)記憶能力的關(guān)鍵。
　　本次主要

10、研究BDE-209暴露對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化、氧化應(yīng)激、DNA甲基化及蛋白磷酸化表達(dá)的影響,探討B(tài)DE-209對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞毒性機(jī)制，分別體外培養(yǎng)海馬NSCs，經(jīng)BDE-209暴露后觀察NSCs分化的形態(tài),檢測(cè)NSCs暴露后向膽堿能神經(jīng)元分化的比例，BDE-209暴露后NSCs氧化應(yīng)激改變及暴露后甲基化、蛋白磷酸化水平的變化，整個(gè)研究分四個(gè)部分進(jìn)行。
　　第一部分 BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響
　　【目的】取大鼠海馬

11、組織進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，研究十溴聯(lián)苯醚對(duì)NSCs分化的影響。
　　【材料與方法】
　　1.購(gòu)買(mǎi)新生1天的SD大鼠，取其海馬組織在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)。
　　2.取培養(yǎng)3-4代后海馬神經(jīng)干細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行NSCs鑒定。
　　3.取培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬NSCs，在含不同濃度的BDE-209血清培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)共分5組，空白對(duì)照組（BC）,DMSO對(duì)照組(VC)，實(shí)驗(yàn)A組：BDE-209濃度為10nM,

12、實(shí)驗(yàn)B組：BDE-209濃度為100nM,實(shí)驗(yàn)C組：BDE-209濃度為1000nM。每組設(shè)6個(gè)平行樣。
　　4.分化培養(yǎng)7天后行免疫熒光的檢測(cè)，運(yùn)用美國(guó)Image-Pro-Plus6.0圖象處理軟件記數(shù)CHAT陽(yáng)性,GFAP陽(yáng)性,DAPI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目,計(jì)算CHAT+/DAPI+，GFAP+/ DAPI+比例。
　　【結(jié)果】
　　1.海馬NSCs培養(yǎng)3-4代后，在倒置顯微鏡下可見(jiàn)許多由數(shù)十到數(shù)百個(gè)細(xì)胞聚集成大小不同的神

13、經(jīng)球，神經(jīng)球折光性強(qiáng)，免疫熒光檢測(cè)證實(shí)為神經(jīng)干細(xì)胞。
　　2.吹打成單細(xì)胞懸液后在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞長(zhǎng)出突起，并形成網(wǎng)狀，經(jīng)細(xì)胞免疫檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)暴露于BDE-209后CHAT+/DAPI細(xì)胞比例下降，GFAP+/DAPI細(xì)胞比例增加。
　　【結(jié)論】分離培養(yǎng)的形成懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球是由數(shù)十到數(shù)百個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞聚集而成， BDE-209可導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞分化成膽堿能神經(jīng)元的比例下降，分化成膠質(zhì)細(xì)胞比例增多。
　　第二部分

14、BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞活性氧及氧化應(yīng)激基因的影響
　　【目的】檢測(cè)不同濃度BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)新生鼠NSCs活性氧及氧化應(yīng)激基因的影響。
　　【材料與方法】
　　1.取傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬NSCs暴露于不同濃度的BDE-20972小時(shí)，實(shí)驗(yàn)共分5組,空白對(duì)照組（BC）,DMSO對(duì)照組(VC)，實(shí)驗(yàn)A組：BDE-209濃度為10nM,實(shí)驗(yàn)B組：BDE-209濃度為100nM,實(shí)驗(yàn)C組：BDE-20

15、9濃度為1000nM。每組設(shè)6個(gè)平行樣。
　　2.用carboxy-H2DCFDA染色檢測(cè)NSCs暴露BDE-209后活性氧的水平。
　　3．經(jīng)qRT-PCR分別測(cè)定氧化應(yīng)激基因SOD2，LDHA，HIF1A，HIF2A的mRNA表達(dá)情況。
　　4.繪制氧化應(yīng)激基因的擴(kuò)增曲線及溶解曲線，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　【結(jié)果】結(jié)果顯示細(xì)胞暴露于不同濃度BDE-209后，ROS產(chǎn)生增多，qRT-PCR結(jié)果顯示SOD mRNA

16、表達(dá)下調(diào)，LDHA，HIF1α，HIF2α mRNA表達(dá)上調(diào)。
　　【結(jié)論】BDE-209可以導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞ROS產(chǎn)生增多,可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激基因表達(dá)異常，從而影響神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力，這可能是BDE-209神經(jīng)毒性的作用機(jī)制之一。
　　第三部分 BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞DNA甲基化的影響
　　【目的】探討不同濃度的BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)新生鼠海馬NSCs DNA甲基化的影響。
　　【材料與方法】

17、>　　1.傳代培養(yǎng)NSCs，取第3-4代的神經(jīng)干細(xì)胞，暴露于不同濃度的BDE-209的培養(yǎng)基后72小時(shí)，分5組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， DMSO對(duì)照組(VC)，空白對(duì)照組（BC）,實(shí)驗(yàn)A組：BDE-209濃度為10nM,實(shí)驗(yàn)B組：BDE-209濃度為100nM,實(shí)驗(yàn)C組：BDE-209濃度為1000nM。每組設(shè)6個(gè)平行樣。
　　2.經(jīng)qRT-PCR分別測(cè)定各組基因DNMT1，DNMT3a，DNMT3b的mRNA表達(dá)情況，經(jīng)Western Blo

18、tting分別測(cè)定DNMT1，DNMT3a，DNMT3b蛋白表達(dá)情況，采用MethylFlash?Methylated DNAQuantification Kit檢測(cè)各組DNA總甲基化水平。
　　3.qRT-PCR繪制基因溶解曲線及擴(kuò)增曲線，對(duì)DNA的總甲基化，DNMT1，DNMT3a，DNMT3b基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　【結(jié)果】不同濃度的BDE-209作用72 h后,可致神經(jīng)干細(xì)胞總甲基化水平下降，

19、甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1,DNMT3a,DNMT3b基因及蛋白表達(dá)下降。
　　【結(jié)論】BDE-209可以導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞總甲基化水平下降，可能與BDE-209導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1,DNMT3a,DNMT3b基因及蛋白表達(dá)下降有關(guān)。
　　第四部分 BDE-209對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞p-ERK1/2、p-JNK1/2、NF-kB蛋白表達(dá)的研究
　　【目的】觀察BDE-209對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞ERK1/2磷酸化、J

20、NK1/2磷酸化，NF-kB表達(dá)的影響。
　　【材料與方法】
　　1.取傳代培養(yǎng)3-4代的新生鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞，在不同濃度BDE-209的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)，實(shí)驗(yàn)共分5組，空白對(duì)照組（BC）,DMSO對(duì)照組(VC)，實(shí)驗(yàn)A組：BDE-209濃度為10nM,實(shí)驗(yàn)B組：BDE-209濃度為100nM,實(shí)驗(yàn)C組：BDE-209濃度為1000nM。每組設(shè)6個(gè)平行樣。
　　2.經(jīng)Western Blotting分別測(cè)定p-ER

21、K1/2，p-JNK1/2，NF-kB蛋白表達(dá)情況
　　【結(jié)果】不同濃度的BDE-209作用72 h后, p-ERK1/2，p-JNK1/2表達(dá)未見(jiàn)明顯異常，NF-kB蛋白表達(dá)增加，與對(duì)照組相比差異均有顯著意義。
　　【結(jié)論】BDE-209在一定劑量和作用時(shí)間內(nèi)可致海馬神經(jīng)干細(xì)胞的NF-kB蛋白表達(dá)增加， p-ERK1/2，p-JNK1/2表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。推測(cè)BDE-209在一定濃度范圍內(nèi)可能通過(guò)NF-kB信號(hào)通路導(dǎo)致神經(jīng)