大鼠角膜緣干細胞體外培養(yǎng)及誘導分化為神經(jīng)干細胞樣細胞的研究.pdf

1、目的：建立鼠角膜緣干細胞體外培養(yǎng)方法。了解全反式維甲酸(RA)對鼠角膜緣干細胞分化為神經(jīng)干細胞樣細胞的影響。探討體外誘導鼠角膜緣干細胞分化為神經(jīng)干細胞樣細胞的可行性。
　　方法：
　?。?）角膜緣干細胞分離、培養(yǎng)與鑒定：取大鼠角膜緣組織消化法進行原代培養(yǎng)（基本培養(yǎng)基為20％FBS，80%DMEM/F12，PS100U/ml），倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的體外生長狀況，隔天半量換液且傳代，培養(yǎng)第七天（傳代培養(yǎng)第5天），免疫細胞化

2、學檢測角膜緣干細胞標志物P63蛋白表達情況，鑒定角膜緣干細胞；
　?。?）角膜緣干細胞的誘導分化：將原代細胞按誘導體系中誘導因素的不同分為3組，對照組：細胞培養(yǎng)液為基本培養(yǎng)基（20%FBS，80%DMEM/F12，PS100U/ml）；實驗組1：在基本培養(yǎng)基中加入EGF(20ng/ml)，bFGF(10ng/ml)；實驗組2：在基本培養(yǎng)基中加入EGF(20ng/ml)，bFGF(10ng/ml)，培養(yǎng)至第5天，再加入RA(25ng

3、/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時；三組均隔天半量換液且傳代，培養(yǎng)至第7天（實驗組2加入RA48小時后），同時收集各組細胞作神經(jīng)元標志物Nestin的免疫細胞化學檢測，陽性細胞計數(shù)，相關數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學分析。
　　結果：
　?。?）角膜緣干細胞分離、培養(yǎng)與鑒定：第三天可見細胞形成許多小集落，集落細胞呈圓球形；培養(yǎng)第七天（傳代培養(yǎng)第5天），細胞形成較大的集落，免疫細胞化學結果顯示：P63陽性細胞數(shù)量多，占細胞數(shù)的（82.19±5.32）%

4、。
　?。?）角膜緣干細胞的誘導分化：分組誘導培養(yǎng)第7天，實驗組1和實驗組2培養(yǎng)細胞Nestin均呈陽性表達，陽性率分別為（77.01士6.32）%和（84.01士5.43）%，對照組培養(yǎng)細胞Nestin呈陰性表達。統(tǒng)計學分析證實，實驗組2和實驗組1相比，實驗組2鼠角膜緣干細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細胞樣細胞的比率高于實驗組1。
　　結論：
　?。?）消化法適用于鼠角膜緣干細胞的體外培養(yǎng)。
　?。?）體外誘導鼠角膜緣干細