母源性BDE-209暴露對(duì)仔鼠海馬神經(jīng)發(fā)育相關(guān)蛋白、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是一系列含溴原子的芳香族化合物。根據(jù)苯環(huán)上溴原子的個(gè)數(shù)和位置的不同，多溴聯(lián)苯醚總共有209種同分異構(gòu)體?？梢宰鳛樽枞紕┨砑尤攵喾N電子產(chǎn)品、塑料泡沫、裝飾材料等產(chǎn)品之中。當(dāng)這些產(chǎn)品報(bào)廢后不經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的回收和后期處理，而隨意廢置于自然界，產(chǎn)品中的化學(xué)阻燃劑成分將進(jìn)入人類(lèi)的生存環(huán)境，且難以降解，形成持續(xù)性有機(jī)污染物。通過(guò)水氣揮發(fā)、空氣流動(dòng)等途徑在環(huán)境中傳播，并進(jìn)入食物鏈，易在生物體包括人體的脂肪組織中聚集，對(duì)人類(lèi)及整個(gè)生

2、態(tài)系統(tǒng)造成潛在危害。 由于PBDEs結(jié)構(gòu)類(lèi)似于PCBs(多氯聯(lián)苯醚，目前已被禁止生產(chǎn)使用)和甲狀腺激素(生物神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵激素之一)，從PBDEs開(kāi)始使用至今，對(duì)其毒性的研究一直受到人們的關(guān)注。以往研究主要為低溴類(lèi)如BDE-99，47，153等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其生物毒性明顯，可導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂，神經(jīng)行為失常，其某些代謝物可能具有致癌性等。在母胎醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，目前認(rèn)為PBDEs可以通過(guò)胎盤(pán)屏障和血腦屏障等進(jìn)入胎兒體內(nèi)或進(jìn)入腦組織，以致胎

3、兒腦組織的發(fā)育不良，因此在美國(guó)以及歐洲等地相繼被限制生產(chǎn)及使用。 BDE-209是PBDEs家族中含溴最高的一種化合物，在全球范圍內(nèi)使用廣泛。在中國(guó)，空氣、水以及河流沉淀物中BDE-209的含量均高于西方國(guó)家同期水平。由于目前對(duì)BDE-209的毒性不確定，所以世界范圍內(nèi)仍在使用。現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)資料表明的觀點(diǎn)有兩種：(1)BDE-209對(duì)生物體是有害的，包括神經(jīng)發(fā)育毒性，免疫毒性，內(nèi)分泌毒性以及致癌性等，應(yīng)該像低溴的阻燃劑一樣被限制生

4、產(chǎn)使用；(2)由于BDE-209在體內(nèi)的代謝快，蓄積低，在常規(guī)暴露水平下對(duì)機(jī)體不造成影響。由于研究結(jié)果不一致，到目前為止，BDE-209對(duì)生物毒性影響依然未定。 本課題組在2006-2007年已通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)母源性BDE-209暴露可造成仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，提示BDE-209具有神經(jīng)發(fā)育毒性。但BDE-209神經(jīng)發(fā)育毒性的量效關(guān)系及其作用機(jī)制的研究尚未深入。本課題根據(jù)BDE-209脂溶性強(qiáng)，環(huán)境含量高，生物暴露量大，具有生物累積

5、及生物放大效應(yīng)的特點(diǎn)，建立不同劑量BDE-209的母源性暴露動(dòng)物模型，研究母源性BDE-209暴露對(duì)仔鼠海馬結(jié)構(gòu)功能的影響及與染毒劑量的關(guān)系，初步探討B(tài)DE-209神經(jīng)發(fā)育毒性的作用機(jī)制。本課題將分為以下四個(gè)部分進(jìn)行各項(xiàng)具體實(shí)驗(yàn)。 第一章:母源性BDE-209暴露對(duì)仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織結(jié)構(gòu)的影響 [目的]:建立不同劑量BDE-209的母源性暴露動(dòng)物模型，觀察仔鼠海馬組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)的改變，并對(duì)仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測(cè)

6、。觀察母源性BDE-209暴露對(duì)仔鼠海馬結(jié)構(gòu)功能的影響及與劑量的關(guān)系。 [材料與方法]: 1.建立動(dòng)物模型：購(gòu)買(mǎi)3月齡SPF級(jí)wistar雌鼠50只，雄鼠25只。分籠飼養(yǎng)7天后，按雌:雄2:1比例合籠，自雌鼠妊娠0天起，隨機(jī)分為五組：實(shí)驗(yàn)組(A)：孕哺期胃灌母鼠BDE-209(100mg/kg·d)；實(shí)驗(yàn)組(B)：孕哺期胃灌母鼠BDE-209(300mg/kg·d)；實(shí)驗(yàn)組(C)：孕哺期胃灌母鼠BDE-209(600mg

7、/kg·d)；實(shí)驗(yàn)組(D)：孕哺期胃灌母鼠BDE-209(1200mg/kg·d)；對(duì)照組(E)：孕哺期胃灌母鼠等量花生油。每日一次。 2.Morris水迷宮測(cè)試：仔鼠斷乳后1周，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法各組隨機(jī)選取雄性仔鼠20只，進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，共8天，前3天訓(xùn)練，后5天記錄成績(jī)做為測(cè)試結(jié)果。每天上午、下午各1次。觀察仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化。 3.制作病理切片：水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)選取5只仔鼠，予4％多聚甲醛及生理鹽水進(jìn)

8、行心臟灌注固定后，取海馬組織4％多聚甲醛固定24小時(shí)，經(jīng)過(guò)洗滌、脫水、浸蠟、包埋、切片與粘片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片等步驟后制成病理切片，光鏡下觀察海馬組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化。 [結(jié)論]:高劑量母源性BDE-209暴露可以影響仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力，破壞仔鼠海馬組織結(jié)構(gòu)。提示BDE-209具有神經(jīng)毒性，影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，并且具有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。 第二章:母源性BDE-209暴露對(duì)仔鼠海馬CaMKII、BDNF及GAP-

9、43的影響 [目的]:CaMKII、GAP-43及BDNF是與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要的特異性蛋白，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及其神經(jīng)元之間信號(hào)的傳導(dǎo)起著重要調(diào)控作用，包括神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化及突觸形成。海馬是與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的重要腦區(qū)。我們通過(guò)觀察母源性BDE-209暴露后仔鼠海馬CaMKII、GAP-43及BDNF的變化，探討母源性BDE-209對(duì)仔鼠神經(jīng)發(fā)育相關(guān)蛋白的影響。 [材料與方法]: 1.水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)選

10、取10只仔鼠，斷頭處死，在冰帽上快速分離海馬，置于液氮中保存。制成組織勻漿后，用ELISA法檢查海馬CaMKII活性。 2.各組隨機(jī)選取5只仔鼠，予4％多聚甲醛及生理鹽水進(jìn)行心臟灌注固定后，取海馬組織4％多聚甲醛固定24小時(shí)，制作石蠟切片，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)BDNF及GAP-43在海馬組織中的表達(dá)。 [結(jié)論]:高劑量母源性BDE-209暴露可以降低仔鼠海馬CaMKII的含量及GAP-43、BDNF的表達(dá)，從而影響神經(jīng)元

11、的生長(zhǎng)、發(fā)育及突觸形成，對(duì)其功能的發(fā)揮造成損傷。 第三章:母源性BDE-209暴露對(duì)仔鼠海馬SOD活性及MDA含量的影響 [目的]:外源性化學(xué)物誘發(fā)自由基反應(yīng)，擾亂機(jī)體的氧化與抗氧化平衡狀態(tài)，從而產(chǎn)生相應(yīng)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，導(dǎo)致機(jī)體功能紊亂已成為化學(xué)物質(zhì)重要毒性機(jī)制，且氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)在神經(jīng)毒性機(jī)制研究中占有重要地位。我們通過(guò)觀察母源性BDE-209暴露后仔鼠海馬SOD活性及MDA含量的變化，探討B(tài)DE-209神經(jīng)毒性的作用機(jī)制。

12、 [材料與方法]: 1.水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)選取10只仔鼠，斷頭處死，剝出全腦，掀開(kāi)大腦皮層，用眼科鑷小心分離海馬組織，40C生理鹽水漂洗去血液，放入凍存管，立即置于液氮內(nèi)保存。 2.采用黃嘌呤氧化法測(cè)定SOD，以每毫克海馬組織蛋白在1ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)亞硝酸鹽單位(U/mgprot)；硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA，以nmol/mgprot表示；考馬斯亮蘭法測(cè)定海馬中蛋白含量

13、。用550nm分光光度計(jì)測(cè)定其OD值，并計(jì)算各組仔鼠海馬組織中SOD的活力和MDA的含量。 [結(jié)論]:高劑量母源性BDE-209暴露可以使仔鼠海馬SOD活力下降，MDA含量升高，出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)，干擾氧化與抗氧化平衡系統(tǒng)，導(dǎo)致氧化損傷，破壞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能。氧化應(yīng)激可能是母源性BDE-209神經(jīng)毒性作用機(jī)制之一。 第四章:母源性BDE-209暴露對(duì)仔鼠海馬Bax、Bcl-2mRNA表達(dá)的影響 [目的]:神經(jīng)系

14、統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞凋亡對(duì)于維持細(xì)胞總體數(shù)量具有重要的作用，是許多神經(jīng)損傷后神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式，與腦功能受損密切相關(guān)。我們通過(guò)觀察母源性BDE-209暴露后仔鼠海馬凋亡基因Bax、Bcl-2mRNA表達(dá)的變化，探討B(tài)DE-209對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。 [材料與方法]: 1.水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)選取5只仔鼠，斷頭處死，在冰帽上快速分離海馬，置于液氮中保存。 2.提取海馬總RNA，紫外分光光度法測(cè)RNA濃度及

15、純度； 2.設(shè)計(jì)引物及合成(分別設(shè)計(jì)并合成Bcl-2及BaxmRNA的引物)； 3.逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR反應(yīng)； 4.制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板； 5.PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳。 [結(jié)論]:母源性BDE-209暴露后仔鼠海馬區(qū)Bcl-2mRNA表達(dá)下調(diào)，BaxmRNA表達(dá)上調(diào)，并具有劑量.效應(yīng)關(guān)系。提示：母源性BDE-209暴露可引起仔鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，Bcl-2和Bax可能參與調(diào)控了細(xì)胞凋亡過(guò)程，母源