G-CSF對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞及其對缺血缺氧性腦損傷的作用及機制研究.pdf

1、粒細胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是生長因子家族的一員,主要功能是刺激定向祖細胞向中性粒細胞分化。自上世紀九十年代開始應用于臨床,主要用于減少癌癥病人化療后粒細胞減少后引起的感染,治療嚴重的先天性粒細胞減少癥。目前的臨床研究表明,G-CSF是副作用很少,非常安全的一種藥物。G-CSF對包括神經(jīng)細胞在內的多種細胞也有營養(yǎng)作用。最近的研究表明,G-CSF有神經(jīng)保護作用

2、,但是G-CSF的神經(jīng)保護作用的具體分子機制仍不明確。
　　 本研究組和國外的一些研究發(fā)現(xiàn),在大鼠腦許多區(qū)域的神經(jīng)細胞上都有粒細胞集落刺激因子受體(Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSFR)的表達。研究表明,在嚙齒類的中樞系統(tǒng)中,發(fā)生大腦中動脈梗塞和再灌注損傷時,神經(jīng)細胞上G-CSF和G-CSFR的表達會上調。最近的研究發(fā)現(xiàn),G-CSFR在不同發(fā)育程度的大鼠胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個區(qū)

3、域均有表達,并且在神經(jīng)前體細胞和膠質前體細胞上均有表達,這表明G-CSF在神經(jīng)發(fā)育過程中可能有非常重要的作用。但是,G-CSF對神經(jīng)干細胞有沒有作用,有什么樣的作用,以及其可能的機制是什么,至今尚未見報道。
　　 近年來關于G-CSF神經(jīng)保護作用的研究成果主要集中在兩方面:G-CSF能動員CD34+的造血干細胞從骨髓遷移到外周血,顯著減少梗死的區(qū)域和提高存活率；G-CSF通過調節(jié)凋亡相關蛋白的表達抑制細胞凋亡。關于G-CSF是否

4、可能通過動員內源性NSCs的增殖從而促進腦損傷的修復未見相關報道。因此,我們首先在體外分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞,采用免疫熒光、Western blot等技術方法,研究G-CSF對神經(jīng)干細胞的作用及作用機制。在此基礎上,建立了缺血缺氧性腦損傷模型,檢測G-CSF對內源性神經(jīng)干細胞的作用,從而為臨床上應用G-CSF治療神經(jīng)損傷相關疾病提供了新的理論依據(jù)。
　　 一、體外研究G-CSF對神經(jīng)干細胞的作用
　　 于小鼠妊娠后12.5天

5、,應用體視顯微鏡成功分離胚胎神經(jīng)管前端腦泡,經(jīng)機械吹打獲取細胞懸液,接種于無血清培養(yǎng)基,獲得神經(jīng)干細胞(neural stemcells,NSCs)。應用5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)標記以及巢蛋白(Nestin)免疫熒光染色技術檢測其增殖和更新能力,采用神經(jīng)元特異性微管相關蛋白2(microtubule associated protein2,MAP2)和神經(jīng)膠質細胞特異性膠質原纖

6、維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫熒光染色法檢測了其分化情況。實驗結果顯示,獲得的是具有增殖能力和分化潛能的NSCs,可以用于后續(xù)實驗研究。我們首先用免疫熒光和RT-PCR方法檢測了G-CSFR是否在NSCs表達,之后通過MTT分析法檢測了G-CSF對NSCs活性的影響,結果顯示,G-CSF可提高NSCs的增值活性,而且該作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴關系,當G-CSF的濃度為100 ng

7、/ml時,細胞的活性最高。后續(xù)采用此濃度研究了G-CSF對NSCs的增殖和分化作用。研究發(fā)現(xiàn),G-CSF處理組的細胞增殖率明顯高于對照組。說明G-CSF能促進NSCs的增殖。我們還用低濃度FBS的培養(yǎng)基中研究,研究了G-CSF對NSCs分化的影響,結果顯示,G-CSF能促進NSCs的分化,尤其在培養(yǎng)后第三天和第五天表現(xiàn)更為顯著。
　　 二、G-CSF促進NSCs增殖和分化機制的研究
　　 分別在G-CSF加入后5、15、

8、30、60和75 min收集細胞,用Western blot方法研究STAT3和p-STAT3蛋白的表達狀況。結果顯示,STAT3的表達在所有時間點未發(fā)生明顯變化,而活化型STAT3即p-STAT3的表達則在5 min開始升高,至30 min到達峰值,之后開始下降,至75 min接近正常水平。這表明,G-CSF與NSCs表面相應受體結合,能誘導STAT3的快速活化。加入G-CSFR的抗體后,p-STAT3的活化水平和細胞的增殖率均明顯低

9、于單純G-CSF作用組,而和對照組水平接近。提示STAT3的活化參與了G-CSF對NSCs增殖的促進作用。
　　 為了研究G-CSF對NSCs分化的可能機制,我們應用RT-PCR方法檢測了與NSCs分化密切相關的bHLH家族主要轉錄因子的表達變化,結果顯示,Neurogl、NeuroD2、Mashl、Idl和Hes5的mRNA水平與對照組相比均有顯著升高。其中Neurogl、NeuroD2、Mashl和Idl四個轉錄因子不僅mR

10、NA水平高于對照,并且在G-CSF處理組的峰值均比對照組提前出現(xiàn)。更有趣的是,我們應用免疫熒光、Western blot和RT-PCR.等方法研究發(fā)現(xiàn)在無FBS存在時,G-CSF不能獨立啟動NSCs的分化。
　　 三、缺血缺氧性腦損傷模型的建立及G-CSF神經(jīng)保護作用的研究
　　 以往的研究顯示,G-CSF有神經(jīng)保護作用,但其分子機制不明。本研究采用新生小鼠單側頸總動脈永久性結扎后給予低濃度氧氣的方法,建立穩(wěn)定的缺血缺氧

11、性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)模型。結果顯示,G-CSF治療組同側腦含水量明顯低于HIBD組,海馬區(qū)神經(jīng)元的排列也較HIBD組規(guī)則,凋亡分析發(fā)現(xiàn),G-CSF治療組的細胞凋亡顯著低于HIBD組,這與其他研究者的實驗結果一致。在關于受體表達研究中,G-CSF治療組G-CSF-R的表達與MAP2共定位,且表達顯著高于HIBD組,說明G-CSF可促進神經(jīng)元上G-CSFR的表達。為了探討G-CSF

12、抑制細胞凋亡的機制,我們檢測了Bcl-2、Bax和Caspase3的蛋白表達,結果顯示,G-CSF處理組Cleaved caspase3和Bax的表達水平明顯低于HIBD組而Bcl-2卻明顯高于HIBD組,提示Caspase3、bax和Bcl-2共同參與了G-CSF對HIBD后腦細胞的抗凋亡作用。
　　 四、G-CSF促進內源性NSCs的增殖的實驗研究
　　 為了探討G-CSF在缺血缺氧性腦損傷中對內源性NSCs的作用,

13、我們分別檢測了大腦半球皮質、海馬、齒狀回(Dentate gyrus,DG)和室管膜下區(qū)(Subventricularzone,SVZ)等區(qū)nestin的表達,G-CSF-R的表達以及海馬DG區(qū)和SVZ區(qū)細胞增殖的情況。結果顯示,G-CSF顯著促進nestin在大腦半球皮質,海馬、DG和SVZ區(qū)的表達,并且G-CSF在HIBD處理后較長時間仍能維持SVZ區(qū)nestin的高水平表達,這可能是G-CSF對缺血缺氧性后小鼠腦有保護作用的機制之

14、一。海馬的DG區(qū)nestin和BrdU的雙標結果及SVZ區(qū)的BrdU免疫熒光結果顯示,G-CSF可促進NSCs的增殖。
　　 結論:
　　 G-CSF能促進外培養(yǎng)的NSCs的存活,并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。G-CSF能促進NSCs的增殖,并上調p-STAT3的蛋白表達。G-CSF能調節(jié)NSCs分化相關基因的表達,促進神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的分化。在HIBD模型中,G-CSF能通過調節(jié)凋亡相關蛋白的表達減少神經(jīng)元的凋亡。同時