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文檔簡介
1、目的:
發(fā)生于頜面部的先天缺損,外傷以及腫瘤切除等引起的后天頜面缺損,不僅會造成嚴重的頜面部生理功能障礙,還會使容貌損毀,給患者造成嚴重的心里障礙,因而必須進行缺損修復(fù)?,F(xiàn)代的再生醫(yī)學(xué)理念為頜面缺損修復(fù)提供了新思路。由于頜面部包含非常復(fù)雜的骨和軟骨系統(tǒng),因此骨再生及骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)成為頒面部再生修復(fù)研究的重點和難點。
在成骨過程中,需要血管源源不斷的提供成骨所需要的養(yǎng)分以及細胞因子,同時血管也可以及時排走代謝產(chǎn)物。研究表明
2、成骨過程與一種特殊的“H”型血管偶聯(lián),即此種血管的發(fā)生與成骨作用發(fā)生的時空相同,且相互促進。因此成骨成血管偶聯(lián)的研究對促進骨的再生,影響局部改建,調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)等方面具有重要意義。GSK-3β是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶,參與調(diào)節(jié)多種體內(nèi)信號通路。預(yù)實驗表明體內(nèi)GSK-3β活性增高的基因小鼠在年老以及卵巢摘除后不出現(xiàn)骨質(zhì)疏松現(xiàn)象,同時“H”型血管的表達量也較對照明顯為多。我們推測GSK-3β可通過調(diào)節(jié)成骨成血管作用來維持骨量。
本課題
3、將重點放在了GSK-3β+/-對“H”型血管的調(diào)控作用機制上,通過體內(nèi)體外多種實驗手段,證明并闡釋了GSK-3β對“H”型血管的可能調(diào)控機制,探索了將GSK-3β作為日后促進成骨以及骨改建相關(guān)靶點的可能性,為骨再生的研究提供新的科學(xué)理論。
方法:我們利用以下的實驗動物及技術(shù)來闡明GSK-3β對成骨成血管偶聯(lián)的影響及可能的機制。
1)GSK-3β活性表達上升的GSK3btmlGrc/j小鼠(后文用GSK-3β+/-小鼠
4、代替)培育及鑒定;
2)GGSK-3β活性抑制劑一LiCl藥物干預(yù)方法;
3)體內(nèi)外中和抗體干預(yù)方法;
4)骨質(zhì)疏松模型(OVX法)
5)顯微CT與醫(yī)學(xué)圖像處理方法;
6)破骨前體細胞體外培養(yǎng)方法;
7)管腔形成實驗方法;
8)PCR、Western Blot和Elisa方法;
9)特殊染色,免疫組織化學(xué),激光共聚焦顯微鏡觀察方法。
結(jié)果:
5、 1.成功培育并純化GSK-3β+/-小鼠,基因型鑒定后利用GSK-3β活性試劑盒以及免疫組織化學(xué)技術(shù)證明該小鼠的骨髓全細胞GSK-3β活性較野生型小鼠為高,該GSK-3β小鼠可作為研究GSK-3β對骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)作用的先進實驗工具。
2.通過在GSK-3β+/-小鼠上建立OVX骨質(zhì)疏松模型,我們發(fā)現(xiàn)GSK-3β體內(nèi)活性增強可以阻止OVX帶來的骨質(zhì)疏松效應(yīng),與此同時骨小梁表達的“H”型血管量明顯較野生型為多,提示此種骨質(zhì)疏松的對
6、抗效應(yīng)與成骨成血管偶聯(lián)有關(guān)。
3.利用Elisa對破骨、成骨和成血管因子進行分析,我們篩選出破骨相關(guān)因子CTX-1在不同組間血清學(xué)表達的明顯不同。我們緊接著利用免疫組織化學(xué)技術(shù)對破骨水平進行了測定,發(fā)現(xiàn)GSK-3β活性增強的小鼠體內(nèi)破骨水平明顯上升。因此GSK-3β可能通過調(diào)節(jié)破骨相關(guān)的機制通過成骨成血管偶聯(lián)作用調(diào)節(jié)骨量。
4.PDGF-BB是調(diào)節(jié)“H”型血管的重要因子,其主要由破骨前體細胞分泌。我們發(fā)現(xiàn)GSK-3β
7、的活性可直接影響PDGF-BB的分泌水平,進而影響管腔形成水平。體外管腔形成實驗表明高活性GSK-3β水平的破骨前體細胞分泌物可以明顯提高管腔形成的水平,反之則明顯抑制管腔形成。此作用可直接通過PDGF-BB本身的促管腔形成功能和間接通過影響VEGF的分泌而進一步影響管腔形成而達成。對不同的破骨前體細胞條件培養(yǎng)液的分析則表明其中PDGF-BB因子的表達量明顯不同。體內(nèi)和體外實驗中利用PGDF-BB中和抗體對PDGF-BB進行的中和后發(fā)現(xiàn)
8、高活性GSK-3β的調(diào)節(jié)促進管腔及成血管作用消失,提示PDGF-BB可能是GSK-3β調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)及改建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
5.通過體內(nèi)切片和體外細胞培養(yǎng)的TRAP染色發(fā)現(xiàn),高活性GSK-3β在體內(nèi)可使機體生成更多的破骨前體細胞,在體外可使單核巨噬細胞系統(tǒng)在破骨誘導(dǎo)的作用下更快的進入破骨前體細胞期。此結(jié)果提示GSK-3β可能通過調(diào)節(jié)破骨前體細胞的數(shù)量進而調(diào)節(jié)PDGF-BB的分泌量從而達到調(diào)節(jié)成骨成血管偶聯(lián)的作用。
結(jié)論:
9、r> 本研究發(fā)現(xiàn)了GSK-3β對于骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的重要作用。高GSK-3β活性可通過成骨成血管偶聯(lián)作用對抗骨質(zhì)疏松效應(yīng),維持骨量,這可能與GSK-3β通過提高破骨前體細胞的數(shù)量從而提高體內(nèi)的roGF-BB分泌量有關(guān)。PDGF-BB是此作用鏈條的關(guān)鍵一環(huán),中和PDGF-BB可以抵消高GSK-3β活性對骨量維持的正效應(yīng)。這些實驗結(jié)果提示將GSK-3β作為日后促進成骨以及骨改建相關(guān)干預(yù)靶點的可能性,并為日后骨再生的研究,尤其是成骨成血管偶聯(lián)相關(guān)
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