轉錄因子FOXO3表達抑制對人胚胎干細胞心肌定向分化的影響.pdf

1、背景：心衰，是世界上致死的主要疾病之一。隨著我國人民生活水平的提高及人口老齡化，心血管疾病發(fā)病率持續(xù)升高。隨著干細胞研究的深入，尤其是基于干細胞療法的研究進展，使人為替換病損心肌根治心衰成為可能。然而，經過10多年來臨床前研究和臨床研究的努力，由于缺乏對心肌分化的分子調控機制的足夠了解，細胞療法仍然不能夠作為常規(guī)療法用于心衰病人。轉基因動物研究顯示FOXO家族成員對小鼠的心臟發(fā)育具有重要的調控作用，但尚無其參與人心臟發(fā)育調控的直接證據。

2、我們前期研究結果發(fā)現FOXO3在人心肌分化過程中表達升高且處于轉錄活化狀態(tài)。因此推測FOXO3在人胚胎干細胞向心肌定向分化過程中起到一定的調控作用。
　　目的：通過觀察FOXO3敲低人胚胎干細胞系向心肌細胞分化過程中中胚層及心肌分化特異性標記基因NKX2.5、ISL-1、TBX5、TBX20、Myocardin、Troponin T等的表達變化，觀察FOXO3基因表達的改變對人心肌細胞分化的進程及效率的影響，證實FOXO3在人胚胎

3、干細胞向心肌定向分化過程中的調控作用。
　　方法：
　　1.利用慢病毒載體介導的RNA干擾技術（shRNA）建立FOXO3敲低的HES2人胚胎干細胞系。
　　2.通過蛋白免疫印跡和實時熒光定量PCR技術檢測FOXO3敲低的HES2細胞中FOXO3基因表達情況。
　　3.通過堿性磷酸酶染色、細胞免疫熒光染色、蛋白免疫印跡及實時熒光定量PCR等技術檢測FOXO3敲低HES2細胞多能性特異性標記物的表達情況，觀察FOX

4、O3表達抑制對人胚胎干細胞多能性的影響。
　　4.采用無血清培養(yǎng)技術誘導人胚胎干細胞向心肌細胞分化，在心肌細胞分化的不同時間點檢測細胞中胚層及心肌分化特異性標記基因的表達情況，觀察FOXO3表達抑制對心肌細胞分化的影響。
　　5.流式細胞術檢測誘導心肌細胞分化末期各實驗組細胞中特異性標記肌鈣蛋白T（TroponinT）陽性的細胞比例。
　　結果：
　　1.包裝制備表達FOXO3特異性shRNA的慢病毒，感染HES

5、2細胞并篩選獲得了GFP+/ZEOCIN抗性克隆。
　　2.在篩選得到的GFP+/ZEOCIN抗性HES2細胞中，內源性FOXO3的表達在mRNA水平及蛋白水平均被抑制。
　　3.內源性FOXO3表達的抑制并未改變人胚胎干細胞多能性標志物的表達水平。
　　4.FOXO3表達的抑制影響了人胚胎干細胞向心肌分化過程中的某些心肌分化特異性標記基因的表達。
　　5.FOXO3表達的抑制使人胚胎干細胞向心肌分化末期心肌特異