尼古丁和雙酚A對(duì)胚胎干細(xì)胞定向心肌分化的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　先天性心臟?。ㄏ刃牟。┦悄壳白畛Ｒ姷囊环N出生缺陷，并發(fā)癥較多，嚴(yán)重威脅患兒的生命，對(duì)社會(huì)和家庭造成了極大的影響。已有研究表明，遺傳因素和環(huán)境因素是導(dǎo)致先心病的兩大主要致病因素。這兩種因素單獨(dú)作用或者相互作用均可使胚胎心臟發(fā)育異常。因此，深入研究先心病的發(fā)病機(jī)制以控制其發(fā)病率顯得極其重要。
　　大量的研究發(fā)現(xiàn)，香煙中的尼古丁和環(huán)境中無(wú)處不在的雙酚A均可對(duì)心血管疾病以及胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響。本課題組前期的研究表明，孕期大

2、鼠給予高劑量的尼古丁能夠?qū)е伦哟笫笮呐K間隔缺損，可能與心臟特性轉(zhuǎn)錄因子GATA4、TBX5啟動(dòng)子區(qū)域DNA的甲基化升高有關(guān)，為了進(jìn)一步探索尼古丁和雙酚A可能引起先心病的分子機(jī)制，我們開展了以下研究。
　　方法:
　　1、通過單層分化的方法，誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞hESC-H9定向分化為心肌細(xì)胞，并將其作為體外胚胎心臟發(fā)育的模型。通過探索最佳的分化條件，使胚胎干細(xì)胞能高效而穩(wěn)定地分化為成熟的、有自動(dòng)節(jié)律的心肌細(xì)胞。
　　2、

3、通過CCK-8實(shí)驗(yàn)確定尼古丁干預(yù)分化過程的最適濃度，觀察不同濃度的尼古丁對(duì)干細(xì)胞心肌分化的影響，采用熒光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白質(zhì)印記(Western blot)、免疫熒光等方法檢測(cè)分化過程中心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的改變。
　　3、通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變和CCK-8實(shí)驗(yàn)，確定尼古丁和雙酚A混合物干預(yù)干細(xì)胞心肌分化的最適濃度。采用Western blot檢測(cè)分化不同時(shí)間點(diǎn)心肌細(xì)胞標(biāo)志物的蛋白表達(dá)，并用RT-qPCR檢測(cè)分化

4、第3天、第7天和第14天不同濃度混合物對(duì)胚胎干細(xì)胞干性指標(biāo)Nanog、Sox2、Oct4的影響，并篩選出變化明顯的miR-125b作為后續(xù)分子機(jī)制的研究對(duì)象。
　　4、通過給予miR-125b-mimic和miR-125b-inhibitor來(lái)進(jìn)行過表達(dá)和抑制功能實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)在分化過程中miR-125b和Lin28的靶向關(guān)系，以及對(duì)分化的影響。
　　結(jié)果:
　　1、hESC-H9能高效并穩(wěn)定地分化為有自動(dòng)節(jié)律跳動(dòng)的

5、心肌細(xì)胞的首要條件是在干細(xì)胞的匯合度達(dá)到85％左右時(shí)進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)，干細(xì)胞匯合度過低或者過高都會(huì)極大影響分化結(jié)果。此方法可以使無(wú)飼養(yǎng)層的hESC-H9不經(jīng)過擬胚體階段直接分化形成成熟的心肌細(xì)胞。這些心肌細(xì)胞有明顯的自動(dòng)節(jié)律性，并能高表達(dá)成熟心肌細(xì)胞的分子標(biāo)志物c-TnT、c-TnI、MHC等。
　　2、尼古丁能延長(zhǎng)hESC-H9定向心肌分化過程的時(shí)間，減少自發(fā)跳動(dòng)的心肌細(xì)胞的數(shù)量、范圍和頻率，以高濃度組（100μM）的尼古丁干預(yù)組現(xiàn)

6、象更顯著。不同濃度的尼古丁干預(yù)分化過程時(shí)，100μM濃度的尼古丁能顯著減低分化第3天中胚層特異性標(biāo)志物Mesp1和Brachyury的蛋白表達(dá)水平。我們初步推測(cè)尼古丁延長(zhǎng)hESC-H9定向心肌分化時(shí)間是通過抑制分化過程中中胚層的形成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在分化第14天時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)尼古丁能劑量依賴性的降低心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Tbx5的mRNA表達(dá)水平，因此我們進(jìn)一步推測(cè)尼古丁抑制定向心肌分化是通過抑制GATA4和Tbx5來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　

7、　3、尼古丁和雙酚A(N+B)混合物能抑制hESC-H9定向心肌分化，以高濃度組（10μM）抑制作用最明顯。首先通過RT-qPCR篩選出hESC-H9定向心肌分化過程中變化最為顯著的三種miRNA(miRNA-1、miRNA-134和miR-125b)，其次發(fā)現(xiàn)不同濃度N+B混合物（0.1μM、1μM、10μM）處理分化過程后，與對(duì)照組相比，在分化的不同時(shí)間段能上調(diào)干性標(biāo)志物Nanog、Oct4、Sox2的mRNA的表達(dá)量，而miRNA

8、-134的表達(dá)水平卻明顯下降;通過過表miR-125b功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，N+B高濃度組(10μM)在分化的第7天和第14天均能顯著抑制其靶基因Lin28的mRNA表達(dá)水平。通過miR-125b缺失功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染組(0D-CT)相比較，未分化的hESC-H9轉(zhuǎn)染組(0D-inhibitor)中Lin28的mRNA表達(dá)水平顯著增加。從分化開始到分化的第7天，Lin28的mRNA表達(dá)量隨時(shí)間不斷增加，但相對(duì)于未給藥的轉(zhuǎn)染組(

9、CT-inhibitor)，高濃度轉(zhuǎn)染組(10μM-inhibitor)能降低Lin28的mRNA表達(dá)量，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　本研究首先探索了直接、穩(wěn)定和高效的單層定向心肌分化方法，使人胚胎干細(xì)胞最終形成自發(fā)性跳動(dòng)地成熟心肌細(xì)胞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)尼古丁可能通過延緩中胚層的形成以及降低心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Tbx5的水平來(lái)達(dá)到抑制心肌分化的作用。高濃度的N+B混合物（10μM）抑制心肌分化的機(jī)制可能