人胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 研究目的： 觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells MSCs)的分離和培養(yǎng)，通過(guò)不同濃度的5-氮胞苷(5-aza-dC)誘導(dǎo)大鼠MSCs分化為心肌細(xì)胞的比較，確定合適的的誘導(dǎo)濃度。 研究方法： 抽取大鼠骨髓，采用貼壁培養(yǎng)法分離MSCs，進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，在第4代MSCs中添加誘導(dǎo)劑5-氮胞苷(5-aza)對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)分化，其濃度分別為：Oμmol/L、10μmol/

2、L、30μmol/L，觀察細(xì)胞形念學(xué)的變化，熒光免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果： 5-aza-dC作用24h后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，加入終濃度為10/μmol/L 5-aza-dC的大鼠MSCs，10d后細(xì)胞之間出現(xiàn)連接，排列方向漸趨一致，有肌管形成，部分細(xì)胞則死亡。誘導(dǎo)28d后，細(xì)胞變稀，周圍伸出多個(gè)長(zhǎng)的突起，細(xì)胞形態(tài)大小不一。而加入終濃度為30μmol/L 5-aza-dC的MSCs，在誘導(dǎo)后第5d，細(xì)胞則全部死亡。

3、 結(jié)論： 大鼠MSCs體外在5-氮胞苷作用下可定向分化為心肌樣細(xì)胞。 第二部分 研究目的： 探討5-氮胞苷(5-aza-dC)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor HGF)作為誘導(dǎo)劑，體外誘導(dǎo)人類胚胎干細(xì)胞(Human embryonic stem cell hESC)分化為心肌細(xì)胞的最佳誘導(dǎo)分化濃度。 研究方法： 1．將傳代的hESC(PKU-1-1)接種到

4、低粘附六孔板中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)形成擬胚體(Embryonic Bodies EBs)。7d后，分別將EBs接種到四孔板中貼壁培養(yǎng)，分別以5-aza-dC、HGF為分化誘導(dǎo)劑加入分化培養(yǎng)基中，組合成幾種分化培養(yǎng)基，分別為無(wú)誘導(dǎo)物組；5-aza-dC組，其濃度分別為：2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、2μmol/L；HGF組，其濃度分別為：1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、30ng/ml。通過(guò)觀察出現(xiàn)的自發(fā)搏動(dòng)的E

5、Bs的數(shù)量，計(jì)算各組分化成功的EBs數(shù)． 2．光鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，熒光免疫組織化學(xué)，RT-PCR以及電鏡方法對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行鑒定。組間比較用方差分析及t檢驗(yàn)，以p<0.05，為差異有顯著性，比較各組之間的分化比率。 1.5-aza-dC終濃度為0-10μmol/L時(shí)均能在體外誘導(dǎo)hESC向心肌細(xì)胞分化，2.5-5μmol/L為最佳誘導(dǎo)濃度。Troponin T及Connexin43的表達(dá)呈陽(yáng)性，并可見(jiàn)清晰肌小節(jié)。

6、RT-PCR檢測(cè)MLC-2A、MLC-2V、hANP、β-Actin mRNA表達(dá)陽(yáng)性。電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)。細(xì)胞分化率比較：2.5μmol/L、5μmol/L組之間無(wú)明顯差異(p>0.05)，均明顯高于0μmol/L、10μmol/L(p<0.05)，此外0μmol/L、10μmol/L組之間也沒(méi)有明顯差異(p>0.05)。而20μmol/L組的細(xì)胞大部分出現(xiàn)死亡。 2．HGF終濃度為1ng/ml、5ng/ml、10n

7、g/ml、30ng/ml時(shí)均能在體外誘導(dǎo)hESC向心肌細(xì)胞分化，Troponin T及Connexin43的表達(dá)呈陽(yáng)性，并可見(jiàn)清晰肌小節(jié)。RT-PCR檢測(cè)MLC-2A、MLC-2V、hANP、NKx2.5、GATA-4、a-MHC、β-Actin mRNA表達(dá)陽(yáng)性。細(xì)胞分化率比較：5ng/ml、10ng/ml組之間無(wú)明顯差異(p>0.05)，均明顯高于1ng/ml、30ng/ml組(p<0.05)。 結(jié)論： 5-aza-