成熟心肌細(xì)胞對早期胚胎或胚胎干細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)作用的研究.pdf

1、目的：擬證實(shí)成熟心肌細(xì)胞對早期胚胎或胚胎干細(xì)胞(ESCs)定向分化存在特殊的誘導(dǎo)作用，為建立一套簡單實(shí)用的胚胎干細(xì)胞移植技術(shù)提供理論依據(jù)。 方法：分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，以DAPI(4'6-聯(lián)瞇-2-苯基吲哚)染核作為細(xì)胞標(biāo)記。分別應(yīng)用自然合籠及超排卵技術(shù)獲取昆明小鼠的早期胚胎(8～16細(xì)胞期胚)與心肌細(xì)胞及相關(guān)心肌微環(huán)境共培養(yǎng)；取昆明小鼠(3.5～4天)的囊胚培養(yǎng)后分離出ESCs，以1到2代的小鼠ESCs細(xì)胞團(tuán)與心肌細(xì)胞

2、及心肌成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)。錄像動態(tài)觀察早期胚胎或ESCs向心肌細(xì)胞分化的情況；分別于共培養(yǎng)后3、7、14天行肌鈣蛋白T(cTnT)、α-肌動蛋白(α-Actinin)免疫熒光染色檢測。 結(jié)果： (1)早期胚胎與心肌細(xì)胞或心肌成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時，可繼續(xù)發(fā)育分化，所分化出的細(xì)胞無cTnT表達(dá)。 (2)1代或2代的ESCs細(xì)胞和/或細(xì)胞團(tuán)與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)約7天左右出現(xiàn)節(jié)律搏動的心肌樣細(xì)胞；觀察至14天時，搏動頻率約為30

3、～50次/min。最好實(shí)驗(yàn)批次，可計(jì)數(shù)到1/4以上的ESCs細(xì)胞和/或ESCs細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)節(jié)律性搏動；ESCs細(xì)胞和/或細(xì)胞團(tuán)與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)并添加0.6％的DMSO時，節(jié)律搏動的心肌樣細(xì)胞分化率未見顯著提高。 (3)心肌細(xì)胞誘導(dǎo)組，記錄己搏動和未搏動ESCs誘導(dǎo)分化后的心肌樣細(xì)胞cTnT、α-Actin蛋白熒光染色陽性率為27％；ESCs與心肌成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)組，分化的細(xì)胞cTnT、α-Actin蛋白熒光染色均

4、陰性；0.6％DMSO誘導(dǎo)組中約3％的分化細(xì)胞cTnT、α-Actin蛋白熒光染色陽性；DMSO聯(lián)合心肌細(xì)胞誘導(dǎo)組，其結(jié)果與心肌細(xì)胞誘導(dǎo)組相似。 結(jié)論： (1)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞所提供的微環(huán)境有利于早期胚胎發(fā)育分化，分化出的細(xì)胞可以繼續(xù)發(fā)育增殖。但是，不能誘導(dǎo)出cTnT陽性表達(dá)的心肌樣細(xì)胞，考慮主要是滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化影響了細(xì)胞間的直接接觸，導(dǎo)致誘導(dǎo)失敗。 (2)未經(jīng)建系操作的ESCs可被誘導(dǎo)分化為節(jié)律搏動的