Th17細(xì)胞相關(guān)基因(DPP4、CCR6、IL6R、IL23R)交互作用與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、背景：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種累及周圍多關(guān)節(jié)和滑膜的全身性自身免疫性疾病，主要特征為大量 T淋巴細(xì)胞浸潤，持續(xù)性滑膜炎和關(guān)節(jié)炎，最終造成關(guān)節(jié)不可逆的損傷。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus， SLE）是一種累及全身多臟器的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，主要特征為大量的自身抗體產(chǎn)生，補(bǔ)體激活和免疫復(fù)合物累積，進(jìn)而導(dǎo)致組織和器官損傷。盡管RA和SLE的發(fā)病

2、機(jī)制至今尚未闡明，但許多研究已證實，多種風(fēng)險因素共同作用導(dǎo)致發(fā)病，其中遺傳因素在疾病發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用。雖然目前發(fā)現(xiàn)了較多與 RA和 SLE遺傳易感性具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)的基因，然而此類疾病的遺傳度并不能完全由這些已發(fā)現(xiàn)的易感基因所解釋。一些潛在的遺傳因素如基因-基因間的交互作用則可解釋部分“缺失的遺傳度”。
　　既往研究表明Th17（T helper17, Th17）細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在RA和SLE的發(fā)病和疾病進(jìn)展中均扮演了重要

3、角色。相關(guān)研究證據(jù)顯示多個參與Th17細(xì)胞反應(yīng)調(diào)控的基因存在變異且與 RA和 SLE的遺傳易感性相關(guān)，這些易感位點的發(fā)現(xiàn)從遺傳學(xué)的角度進(jìn)一步驗證了Th17通路在RA和SLE發(fā)病中的關(guān)鍵性作用。最新證據(jù)發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞相關(guān)基因二肽基肽酶4（dipeptidylpeptidase4，DPP4）、趨化因子受體6（chemokine[C-C motif] receptor6，CCR6）、白介素6受體（interleukin6 receptor，

4、IL6R）和白介素23受體（interleukin-23 receptor，IL23R）均是RA的易感基因，其中CD26和CCR6是Th17細(xì)胞重要的表面分子標(biāo)志物， IL6R和IL23R則是Th17細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)中的重要細(xì)胞因子受體。
　　近年來，研究發(fā)現(xiàn)自身免疫性疾病存在著許多共同的遺傳易感基因，提示此類疾病可能存在著共同分子致病機(jī)制和生物學(xué)通路。此外，易感基因在 RA和SLE中存在的基因-基因交互作用相繼被發(fā)現(xiàn)，其中本課題組前

5、期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) Th17細(xì)胞通路的兩個基因 IL21（ interleukin-21）和 ETS1（ E26 transformation-specific-1）在SLE中存在交互作用。因此我們擬在中國漢族人群中研究Th17細(xì)胞相關(guān)基因DPP4、CCR6、IL6R和IL23R在RA和SLE中可能存在的交互作用。
　　目的：
　　本研究擬通過檢測RA和SLE病例與正常對照的Th17信號通路相關(guān)基因位點（DPP4 rs1261

6、7656、CCR6 rs1854853、IL6R rs2228145和IL23R rs7517847）的多態(tài)性，驗證其與中國漢族人群RA遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性，以及研究其與SLE遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性，并進(jìn)一步分析DPP4、CCR6、IL6R和IL23R在RA和SLE中可能存在的基因-基因交互作用。
　　方法：
　　本課題采用病例對照研究設(shè)計方案，分兩階段進(jìn)行研究，第一階段，通過收集 RA、SLE和正常對照相關(guān)資料和血液標(biāo)本，利用

7、Fluidigm192.24 Dynamic Array儀和 TaqMan探針進(jìn)行基因分型檢測，分析 DPP4 rs12617656、CCR6 rs1854853、IL6R rs2228145和IL23R rs7517847的多態(tài)性與RA和SLE遺傳易感性，以及與 RA重要亞型和 SLE主要臨床特征之間的關(guān)聯(lián)性，并進(jìn)一步探索基因間存在的交互作用。第二階段，基于第一階段發(fā)現(xiàn)的基因-基因交互作用，再次收取獨(dú)立樣本（RA、SLE及正常對照），

8、同時進(jìn)行基因分型檢測和酶聯(lián)免疫吸附測定試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），進(jìn)一步驗證發(fā)現(xiàn)的基因-基因交互效應(yīng)以及初步探討交互效應(yīng)與血漿Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子（IL-17、IL-21和IL-22）的關(guān)聯(lián)性。RA、SLE樣本來源于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科和安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科的門診或住院患者，RA診斷依據(jù)為美國風(fēng)濕協(xié)會（American College of Rh

9、eumatology，ACR）1987年修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)；SLE診斷依據(jù)則為ACR1997年修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)。正常對照樣本主要來自于健康獻(xiàn)血員和醫(yī)院體檢中心的正常體檢人員，健康對照的選取需符合既定的標(biāo)準(zhǔn)。
　　利用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)強(qiáng)度用比值比（odds ratio， OR）及95％可信區(qū)間（confidence interval，CI）表達(dá)，運(yùn)用卡方檢驗和Logistic回歸分析方法評估目標(biāo)基因單

10、核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）與RA和SLE遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性。利用Logistic回歸分析方法評估相乘模型的基因-基因交互作用，根據(jù)叉生分析表，并結(jié)合交互作用歸因比（attributable proportion due to interaction，AP）和交互作用超額相對危險度（the relative excess risk due to interaction，RERI）

11、兩個指標(biāo)評估相加模型的基因-基因交互作用?；蚪M合與血漿細(xì)胞因子水平關(guān)聯(lián)性研究則根據(jù)資料的類型進(jìn)行分析，多組資料間比較符合正態(tài)分布且方差齊性的資料采用方差分析，不符合正態(tài)分布的資料采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　（1）第一階段共納入2452個樣本（RA386例，SLE1058例和正常對照1008例）進(jìn)行分析，驗證了DPP4 rs12617656多態(tài)性與中國漢族人群RA遺傳

12、易感性的關(guān)聯(lián)性（T vs. C：P=0.004，OR=1.290，95%CI=1.087-1.530），并進(jìn)一步驗證了 DPP4 rs12617656多態(tài)性與抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（ anti-citrullinated protein antibodies，ACPA）陽性RA遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性（TT vs. TC+CC: P=0.006， OR=1.697，95%CI=1.167-2.467；TT vs. TC vs. CC：P=0.012

13、，OR=1.285，95%CI=1.056-1.563），發(fā)現(xiàn)了DPP4 rs12617656多態(tài)性與類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）陽性RA遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性（TT vs. TC+CC:P=0.011，OR=1.649，95%CI=1.124-2.419；TT vs. TC vs. CC：P=0.028，OR=1.253，95%CI=1.025-1.532）。此外，發(fā)現(xiàn)了IL6R rs2228145多態(tài)性與RA、

14、RF陽性RA遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性（CC vs. CA+AA:P=0.049，OR=1.376，95%CI=1.002-1.891；TT vs. TC+CC:P=0.030，OR=1.476，95%CI=1.038-2.097）。另外，研究發(fā)現(xiàn)DPP4 rs12617656與SLE遺傳易感性之間存在關(guān)聯(lián)性（T vs. C：P=0.039，OR=1.144，95%CI=1.007-1.299）。
　?。?）第一階段RA中基因-基因交互作

15、用研究，發(fā)現(xiàn)DPP4 rs12617656與CCR6 rs1854853存在著相乘模型的交互作用（共顯性模型：P=0.014）和相加模型的交互作用（ AP=0.425，95%CI=0.026-0.824），并發(fā)現(xiàn)DPP4 rs12617656與CCR6rs1854853在ACPA陽性RA中存在相乘模型的交互作用（顯性模型：P=0.030， OR=2.054，95%CI=1.071-3.943；共顯性模型：P=0.002，OR=1.555

16、，95%CI=1.176-2.054）和相加模型的交互作用（AP=0.534，95%CI=0.185-0.882）；在RF陽性RA中也存在著相乘模型的交互作用（顯性模型：P=0.020，OR=1.405，95%CI=1.056-1.870）和相加模型的交互作用（AP=0.459，95%CI=0.045-0.874）。此外，我們發(fā)現(xiàn)了另外一組基因（DPP4 rs12617656與IL6R rs2228145）在RA中存在著相乘模型的交互作

17、用（共顯性模型：P=0.031）；在RF陽性RA中存在相乘模型的交互作用（顯性模型：P=0.034；共顯性模型：P=0.010）。
　?。?）第一階段SLE中基因-基因交互作用研究，發(fā)現(xiàn)DPP4 rs12617656與IL6R rs2228145存在相乘模型的交互作用（隱性模型：P=0.003；共顯性模型：P=0.002）和相加模型的交互作用（ AP=0.686，95%CI=0.436-0.936）。
　?。?）第二階段獨(dú)立

18、樣本基因-基因交互作用研究，進(jìn)一步驗證了 DPP4 rs12617656與CCR6 rs1854853在RA存在相乘模型的交互作用（隱性模型：P=0.001）和相加模型的交互作用（AP=1.088，95%CI=0.859-1.318）。此階段研究未發(fā)現(xiàn)DPP4 rs12617656與IL6R rs2228145在RA和SLE中存在基因-基因交互作用。
　　（5）兩階段樣本合并基因-基因交互作用研究，發(fā)現(xiàn) DPP4 rs126176

19、56與CCR6 rs1854853在RA、ACPA陽性RA中，存在著相乘模型和相加模型的交互作用；DPP4 rs12617656與IL6R rs2228145在RF陽性RA中存在相乘模型的交互作用，以及在SLE中存在相乘模型和相加模型的交互作用。
　　（6）基因組合與血漿Th17相關(guān)細(xì)胞因子（IL-17、IL-21、IL-22）水平及疾病活動度的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)研究基因組合與血漿Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子（IL-17、IL-2

20、1、IL-22）水平及疾病活動度的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)并驗證了DPP4 rs12617656與CCR6 rs1854853在RA中可能存在的基因-基因交互作用，同時發(fā)現(xiàn)了DPP4 rs12617656與IL6R rs2228145在RA和SLE中可能同時存在的基因-基因交互作用，提示Th17細(xì)胞相關(guān)基因在RA和SLE發(fā)生和發(fā)展中可能存在協(xié)同作用，進(jìn)一步說明了Th17細(xì)胞信號通路在自身免疫性疾病尤其在RA和SL