異種脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)移植修復(fù)兔結(jié)膜缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　探討脫細(xì)胞結(jié)膜的制備方法，并觀察其移植修復(fù)兔結(jié)膜缺損的可行性。
　　方法：
　　1.脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)的制備
　　取新鮮豬球結(jié)膜（宰后3小時(shí)，其僅含少許結(jié)膜下組織）先用0.2％戊二醛處理5min，再用0.25%胰酶/0.02%EDTA、1%TritonX-100、或兩者聯(lián)合進(jìn)行脫細(xì)胞處理，根據(jù)DAPI染色結(jié)果篩選出合適的結(jié)膜脫細(xì)胞方法，脫細(xì)胞處理后，將結(jié)膜置于超凈臺(tái)內(nèi)通風(fēng)干燥、紫外消毒8h備用。
　

2、　2.脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)的相關(guān)檢測(cè)
　　使用可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)檢測(cè)脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)的透光性，細(xì)菌、真菌培養(yǎng)行微生物檢測(cè)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)其抗原性，MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性。
　　3.異種脫細(xì)胞結(jié)膜作為移植材料，修復(fù)兔結(jié)膜缺損的應(yīng)用
　?。?）兔結(jié)膜缺損動(dòng)物模型的建立
　　游離去除實(shí)驗(yàn)兔鼻上方約20mm×8mm球結(jié)膜、筋膜，并剪除對(duì)應(yīng)部分瞼結(jié)膜。
　?。?）移植材料的動(dòng)物模型
　　隨機(jī)將20只新西蘭大白兔分成4

3、組，每組5只。A組移植制備的脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)；B組移植羊膜；C組移植未脫細(xì)胞異種結(jié)膜；D組不給予治療。術(shù)后3天，1周，2周，行結(jié)膜熒光素鈉染色大體觀察對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組結(jié)膜愈合、結(jié)膜囊狹窄、結(jié)膜粘連和血管化情況；術(shù)后1周，2周，6周取材處死實(shí)驗(yàn)組兔分別行HE染色，6周后取材行免疫熒光染色，有無(wú)結(jié)膜上皮細(xì)胞蛋白的表達(dá)，活體印記細(xì)胞學(xué)檢查，觀察異種脫細(xì)胞結(jié)膜移植治療結(jié)膜缺損的效果。
　　結(jié)果：
　　1.與TritonX-100和胰酶/

4、EDTA單獨(dú)處理相比，先用1%TritonX-100作用24h，再用0.25%胰酶/0.02%EDTA作用2h，可將豬結(jié)膜中的細(xì)胞脫除干凈。
　　2.脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)的透明度好，無(wú)抗原性，無(wú)細(xì)胞毒性，其膠原纖維排列整齊、結(jié)構(gòu)良好、無(wú)細(xì)胞成分。
　　3.脫細(xì)胞豬結(jié)膜移植組（A組）植片存活良好，1周時(shí)瞼結(jié)膜缺損處可見(jiàn)熒光素鈉染色，移植物覆蓋處光滑不著色，角膜緣處新生血管長(zhǎng)入，HE染色可見(jiàn)單層結(jié)膜上皮細(xì)胞覆蓋；2周后未見(jiàn)熒光素鈉染色

5、著色，移植物大量血管長(zhǎng)入，呈粉紅色外觀， HE染色可見(jiàn)結(jié)膜上皮覆蓋多層細(xì)胞，結(jié)膜印跡細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn)有杯狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞；移植后6周行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)結(jié)膜上皮細(xì)胞角蛋白（PCK）表達(dá)陽(yáng)性，說(shuō)明脫細(xì)胞結(jié)膜基質(zhì)上皮完整。羊膜移植組（B組）1周后羊膜出現(xiàn)溶解吸收，2周后結(jié)膜瘢痕形成。未脫細(xì)胞結(jié)膜移植組（C組）1周后移植的異體結(jié)膜已溶解脫落，2周后結(jié)膜瘢痕形成，未給予治療的結(jié)膜缺損組（D組）2周后均形成結(jié)膜瘢痕。
　　結(jié)論：
　　1.