十足目(Crustacea：Decapoda)經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物谷氨酸脫氫酶基因的研究.pdf

1、游離氨基酸在生物體的滲透調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的作用，谷氨酸是其中最為重要的一種，而谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）作為谷氨酸代謝過程中的關(guān)鍵酶之一，有關(guān)其基因的研究并不多見。同時(shí)，十足目動(dòng)物作為甲殼綱中一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)類群，對(duì)鹽度的適應(yīng)范圍多種多樣。因此，研究十足目中主要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物GDH基因及其與鹽度變化的關(guān)系，將對(duì)深入了解游離氨基酸在滲透調(diào)節(jié)過程中的作用機(jī)制及十足目動(dòng)物的分化演變有著重要的意義。

2、r>　　 本研究在獲得甲殼綱十足目5種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物谷氨酸脫氫酶(GDH)序列片段的基礎(chǔ)上，選擇其中凡納濱對(duì)蝦的GDH-B基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行急性和長(zhǎng)期的鹽度脅迫，研究谷氨酸脫氫酶基因在不同鹽度脅迫條件下的表達(dá)差異及變化規(guī)律，其中主要研究結(jié)果如下：
　　 1．十足目5種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物谷氨酸脫氫酶基因的定性研究
　　 采用常規(guī)PCR技術(shù)，擴(kuò)增獲得了凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）、

3、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatu)、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）肌肉GDH序列片段；通過多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列中的若干高度保守區(qū)域，其中GGVTVS片段在所有已獲得的真核生物GDH序列中表現(xiàn)出高度同源性；在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物類群中又分別存在一個(gè)高度保守區(qū)，綜合已有文獻(xiàn)，根據(jù)

4、結(jié)構(gòu)保守區(qū)的差異，GDH在真核生物中可分為GDH-1和GDH-2兩大類，本研究所獲得的5種GDH序列屬于GDH-2。
　　 2．凡納濱對(duì)蝦谷氨酸脫氫酶的生物信息學(xué)分析
　　 對(duì)獲得的兒納濱對(duì)蝦GDH-B全長(zhǎng)序列進(jìn)行進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦的GDH-B二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在20個(gè)0a-螺旋和14個(gè)B-折疊結(jié)構(gòu)，而利用Swiss-MODEL對(duì)其進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬則發(fā)現(xiàn)14個(gè)a-螺旋和10個(gè)B-折疊結(jié)構(gòu)，兩個(gè)氨基酸保守區(qū)域

5、則分別存在于兩個(gè)B-折疊集中區(qū)域；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在其170-183aa處存在一個(gè)多種氨基酸脫氫酶的活性位點(diǎn)(Glu/Leu/Phe/Val dehydrogenasesactive site) VpfGGAKaGlkiNP，利用Bioedit軟件對(duì)谷氨酸脫氫酶的氨基酸組成進(jìn)行分析表明，該蛋白富含甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸等與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的氨基酸類。結(jié)果提示GDH-B的結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)。
　　 3．急性鹽度脅迫下谷氨酸脫氫酶表達(dá)變化研究

6、
　　 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了急性鹽度脅迫下凡納濱對(duì)蝦肌肉和鰓中GDH的表達(dá)變化情況。發(fā)現(xiàn)無論面對(duì)低鹽脅迫還是高鹽脅迫，GDH-A在肌肉和鰓中均是脅迫后24hr其表達(dá)量最高，在高鹽脅迫下，同一時(shí)刻GDH-A在鰓中的表達(dá)量始終高于其在肌肉中的表達(dá)量，在24hr時(shí)差異最為顯著。GDH-B的變化則稍有差異，在低鹽脅迫時(shí)，其在肌肉和鰓中的表達(dá)量在48hr最高，在高鹽脅迫時(shí)，肌肉中的GDH-B表達(dá)量在48hr最高，但變化不顯著，

7、而鰓中該基因的表達(dá)量在96hr達(dá)到最高，且顯著高于其他時(shí)刻的表達(dá)量。結(jié)果提示，在應(yīng)對(duì)鹽度急性脅迫時(shí)，GDH-A響應(yīng)時(shí)間要早于GDH-B，其主要靶器官為鰓，可能與急性鹽度脅迫下的滲透調(diào)節(jié)關(guān)系更為密切，GDH-B響應(yīng)時(shí)間稍晚，可能在更為復(fù)雜的代謝過程中發(fā)揮作用。
　　 4．長(zhǎng)期鹽度脅迫下谷氨酸脫氫酶表達(dá)變化研究
　　 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了在長(zhǎng)期鹽度脅迫下凡納濱對(duì)蝦肌肉和鰓中GDH的表達(dá)變化情況。發(fā)現(xiàn)在低鹽度(5‰