水稻氮代謝基礎(chǔ)研究：谷氨酸脫氫酶作用的分子機(jī)理.pdf

1、氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育必所需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素中需求量最大的一種，是氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素、激素等的組成成分。植物體內(nèi)氮循環(huán)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到許多酶。其中根吸收的NH4+或NO3-還原產(chǎn)生的NH4+首先通過(guò)谷氨酰胺合成酶（glutamine synetase，GS；EC6.3.1.2）催化產(chǎn)生谷氨酰胺（glutamine，Gln），此反應(yīng)需要消耗一分子ATP。GS常與谷氨酸合酶（glutamate synmase，GOGAT；Fd-G

2、OGAT：EC1.4.7.1和NAD-GOGAT：EC1.4.1.14）協(xié)同作用，組成GS/GOGAT循環(huán)。在這一循環(huán)中GS催化NH4+與谷氨酸（Glutamate，Glu）生成Gln，GOGAT則催化Gln將其酰胺基轉(zhuǎn)移至α-酮戊二酸（α-OG）形成兩分子Glu。另外，NH4+也可通過(guò)谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH；1.4.1.2-4"）催化直接與α-OG反應(yīng)產(chǎn)生Glu，這是一可逆反應(yīng)。GS和GO

3、GAT一起構(gòu)成的循環(huán)是高等植物NH4+同化的主要途徑，而GDH功能還不太清楚。從能量消耗來(lái)看，提高植物中GDH效率是一條提高氮肥利用效率途徑。水稻（Oryza sativa L．）是重要的糧食作物，也是禾谷類作物功能基因組研究的模式植物。本研究以尋求水稻氮高效利用的可能途徑為目標(biāo)，通過(guò)用CaMV35S和Ubiquitm啟動(dòng)子超量表達(dá)小球藻（Chlorella sorokinana）gdh基因，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了分子生物學(xué)研究和表型觀察。

4、同時(shí)通過(guò)超量、抑制以及啟動(dòng)子啟動(dòng)綠色熒光蛋白EGFP基因表達(dá)，來(lái)研究水稻gdh功能，主要指OsGDH1和OsGDH4基因。另外還通過(guò)水稻gdh基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)譜來(lái)研究水稻GDH分子特性，探討它在植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中作用的分子機(jī)理。主要結(jié)果如下：
　　 1．在水稻中存在4種GDH基因（OsGDH1～4）。水稻和其它物種GDH可分為兩類即Ⅰ及Ⅱ。水稻有一個(gè)類似Ⅰ型GDH基因，三個(gè)Ⅱ型GDH基因（OsGDH1～3）。Ⅰ型比Ⅱ型GDH亞基

5、因家族擴(kuò)展速率要慢，其中植物Ⅱ型GDH亞基因家族在進(jìn)化演變時(shí)具有物種偏愛性。
　　 2．基因表達(dá)分析表明OsGDH1、OsGDH2和OsGDH4在所檢測(cè)的大部分組織或器官中都表達(dá)，而OsGDH3只在谷殼和雄蕊中特異表達(dá)。
　　 3．在無(wú)氮（N-）或無(wú)磷（P-）條件下OsGDH基因家族各成員的表達(dá)譜變化互不相同，表明其在這些脅迫條件下的功能也可能各不相同。
　　 4．層次聚類分析（HCA）表明只有OsGDH2和Os

6、GDH4這兩個(gè)基因才與GS和GOGAT這些已知氮代謝過(guò)程中基因聚集到一起。通過(guò)HCA我們還是不能確定GDH在水稻氮代謝中反應(yīng)方向，不過(guò)從HCA分析中我們可看出OsGDH家族各成員功能是非冗余的。
　　 5．以載體p1301S為基礎(chǔ)，構(gòu)建了3個(gè)超量表達(dá)載體，以CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)基因OsGDH1、OsGDH4和gdhANC在水稻中進(jìn)行組成型超量表達(dá)。通過(guò)Southern和Northern雜交，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)和表達(dá)

7、量的檢測(cè)，來(lái)獲得超量表達(dá)的單拷貝轉(zhuǎn)基因植株。超量表達(dá)這些基因的轉(zhuǎn)基因植株，與野生型植株相比其生長(zhǎng)表型沒(méi)有明顯差異，生物產(chǎn)量也沒(méi)有顯著提高。但是生理生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比表現(xiàn)為更高的代謝水平，包括：葉片中GDH活性和籽粒中氮含量。將CaMV35S啟動(dòng)子換成Ubiquitin啟動(dòng)子啟動(dòng)gdhANC在水稻中進(jìn)行組成型超量表達(dá)，所獲得轉(zhuǎn)基因植株也得到類似結(jié)果。
　　 6．非生物脅迫試驗(yàn)結(jié)果表明，超量表達(dá)上述g