EV71感染患兒T、B淋巴細胞及甲型H1N1流感肺炎患兒NO、IFN-γ、IL-17表達水平研究.pdf

1、第一部分EV71感染患兒T、B淋巴細胞表達水平研究
　　腸道病毒71型（EV71）是引起手足口?。℉FMD）及HFMD患兒神經及呼吸系統等并發(fā)癥的主要病原體。EV71病毒感染嚴重的患兒可出現永久性的神經系統并發(fā)癥甚至死亡。EV71病毒是繼脊髓灰質炎病毒后最主要的嗜神經性病毒。近年來我國 HFMD疫情呈明顯上升趨勢，重癥病例不斷增加。同時由于 HFMD一旦在兒童密集地區(qū)爆發(fā)傳染率極高，重癥 HFMD病情變化極快，且伴隨嚴重并發(fā)癥，因

2、此受到社會各界的高度關注。目前EV71病毒感染的致病機理仍未明確，尚未見針對HFMD的有效疫苗和抗病毒藥物，但是眾多實驗數據表明，HFMD患者的免疫功能存在異常，HFMD的發(fā)病及疾病的嚴重程度與 T淋巴細胞、B淋巴細胞等免疫細胞的表達及功能密切相關。目前國內外少數研究顯示 EV71病毒感染可導致機體免疫功能紊亂，但對于免疫應答在 EV71病毒感染發(fā)病中的具體作用機制尚不清楚，既往關于EV71病毒感染患兒T細胞和B細胞亞群的研究以及各亞群

3、間相互關系的研究極少，因此研究這兩類細胞亞群在 HFMD發(fā)病中的作用機制以及各細胞亞群間的相互關系，可深化對 HFMD發(fā)病機制的認識，為其臨床診治以及判斷預后提供新的思路。
　　目的：分析 EV71感染患兒外周血中 T細胞亞群（Th1、Th2、Th17、Treg、Tc1、Tc2、Tc17、Tfh、IL-21+CD3+CD8+）的表達水平，T細胞亞群的特征性轉錄因子的表達水平，探討T細胞亞群之間、T細胞亞群與轉錄因子間的相互關系，以

4、及它們在HFMD中的發(fā)病機制及作用；了解 EV71感染患兒外周血中 B淋巴細胞及 B10細胞的表達水平，確定 EV71感染患兒外周血 B10（IL-10+CD19+）細胞的負向免疫調節(jié)功能，探討其在EV71感染患兒中的重要作用及臨床意義。
　　方法：研究對象為2014年11月至2015年7月廣州市婦女兒童醫(yī)療中心收治的EV71感染患兒32例，手足口病診斷均符合衛(wèi)生部制定的《手足口病診治指南（2010年版）》診斷標準，咽拭子 EV7

5、1病毒核酸檢測及 EV71病毒培養(yǎng)陽性并排除其他兒童常見病原體感染。對照組32例，咽拭子 EV71病毒核酸檢測陰性，收集64例實驗對象的臨床資料及外周血標本。利用流式細胞術觀察患兒外周血單個核細胞(PBMC)中 T細胞亞群（ Th1、Th2、Th17、Treg、Tc1、Tc2、Tc17、Tfh、IL-21+CD3+CD8+）的表達水平，B淋巴細胞及B10細胞的表達水平；利用RT-PCR方法分析EV71感染患兒及健康對照者外周血中 T-b

6、et、Gata3、RORγt、Foxp3、TCF-1、Bcl-6 mRNA的表達水平。數據分析用SPSS18.0統計學軟件分析，兩組間比較正態(tài)分布時采用t檢驗，數據以均值±標準差（ X±S）表示，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。方差不齊性或數據不服從正態(tài)分布時,釆用非參數檢驗中的 Mann-Whitney U檢驗,結果表示為均值及四分位數間(25％-75%)。P<0.05為差異具有統計學意義。相關性分析應用 Pea

7、rson相關性檢驗。
　　結果：與對照組相比，EV71組 CD3+T、Th（CD3+CD4+）、Tc(CD3+CD8+)細胞明顯下降； EV71組 Th1（ IFN-γ+CD3+CD4+）、 Tc1(IFN-γ+CD3+CD8+)、Treg(CD4+CD25hiCD127low)與對照組相比明顯降低，Th2（IL-4+CD3+CD4+）、Tc2（IL-4+CD3+CD8+）、Th17（ IL-17+CD3+CD4+）、Tc17（

8、IL-17+CD3+CD8+）、Tfh（ IL-21+CD3+CD4+）、IL-21+CD3+CD8+、CD19+、B10(IL-10+CD19+)細胞與對照組相比明顯升高；與對照組相比 EV71組 RORγt、Bcl-6、TCF-1的 mRNA表達量升高， T-bet、Gata3、Foxp3的 mRNA的表達量降低；EV71組中 Thl與 Treg、Tfh與 IL-21+CD3+CD8+、Thl7與 Tfh、Treg與 Thl7細胞表

9、達在 EV71組中呈正相關關系，在對照組中無相關性； Thl與中性粒細胞、Th2與Treg細胞在EV71組中表達呈負相關關系，在對照組中無相關性；Thl與 Tc1、Thl7與 RORγt表達在 EV71組和對照組均呈正相關關系；EV71感染患兒外周血中 Th1/Th2比值較對照組明顯下降,Th17/Treg比值較對照明顯升高。
　　結論：
　　1. EV71感染患兒外周血 T淋巴細胞表達總體下調，在 T淋巴細胞亞群中 Th2

10、、Tc2、Th17、Tc17、Tfh、IL-21+CD3+CD8+細胞表達上調，Th1、Tc1、Treg細胞的表達下調，說明各T細胞亞群在EV71病毒的致病過程中各自發(fā)揮不同的作用。
　　2. EV71感染患兒B淋巴細胞及B10細胞表達上調，提示B淋巴細胞及B10細胞可能與HFMD的病情進展有關。
　　3. EV71感染患兒存在Th1/Th2和Th17/Treg的比值失調,這種失調可能在感染的病理生理過程中起作用。
　

11、　4. EV71感染患兒Thl與Treg、Tfh與IL-21+CD3+CD8+、Thl7與Tfh、Treg與Thl7細胞表達呈正相關關系，Thl與中性粒細胞、Th2與 Treg細胞表達呈負相關關系，說明這些細胞亞群間相互影響，彼此聯系。
　　5. EV71感染患兒轉錄因子 T-bet、Gata3、Foxp3、RORγt、TCF-1、Bcl-6的 mRNA表達量存在異常，提示其可能在轉錄水平影響機體的抗病毒反應。
　　第二部分

12、甲型H1N1流感肺炎患兒NO、IFN-γ及IL-17表達水平研究
　　甲型 H1N1流感病毒可引起一種新型呼吸道傳播疾病。通過飛沫、氣溶膠、直接接觸或間接接觸傳播,臨床主要表現為流感樣癥狀,少數病例病情重,進展迅速,可出現病毒性肺炎,合并呼吸衰竭、多臟器功能損傷,嚴重者可以導致死亡。自2009年3月暴發(fā)于墨西哥后，迅速在全球范圍內蔓延。由于流感病毒的變異性大，感染后發(fā)病率高、傳染性強，嚴重威脅著人類的健康。
　　目的:本文通

13、過探討甲型H1N1流感肺炎患兒一氧化氮（nitric oxide，NO）含量及細胞因子水平與機體免疫狀態(tài)的關系及其檢測的臨床意義?？偨Y其特點，以期為甲型H1N1流感肺炎的診治提供一定的實驗依據
　　方法:2009年7月至12月于廣州市婦女兒童醫(yī)療中心住院的甲型H1N1流感肺炎患兒，發(fā)病初期（3天內）采集咽拭子，應用熒光定量 RT-PCR法檢測其感染病原學情況，選取甲型H1N1流感病毒（influenza AH1N1virus）陽性

14、且未合并其它兒童常見病原體感染的肺炎患兒30例為病例組；同期保健門診體檢兒童30例為對照組，RT-PCR法檢測其H1N1及兒童常見病原體核酸陰性。所有入組兒童留取血清及 EDTA抗凝全血標本，應用 Griess法測定各組兒童血清總 NO和亞硝酸鹽（NO2-）含量；ELISA法檢測各組兒童血清細胞因子IFN-γ及IL-17水平；并采用四色流式細胞術對兩組兒童進行外周血淋巴細胞各亞群檢測。
　　結果:甲型H1N1流感肺炎患兒血清中總N

15、O含量、NO2-水平及IL-17水平較對照組均顯著升高（P<0.01），差異有統計學意義；而血清IFN-γ水平與對照組相比有所降低，但未見統計學差異（P>0.05）。另外，甲型H1N1流感肺炎患兒外周血CD3+、CD3+CD4+ T淋巴細胞比例以及CD56+CD16+ NK細胞比例均明顯下降（P<0.05）；CD19+ B淋巴細胞比例則顯著升高（P<0.01）；而CD3+CD8+T淋巴細胞以及CD4-CD8--雙陰性（double ne