擬南芥AtLrgB基因的進(jìn)化分析與功能研究.pdf

1、細(xì)菌的IrgA/B和cidA/B操縱子編碼胞壁質(zhì)水解酶調(diào)控因子，在細(xì)菌的自我分解機(jī)制中起重要作用．?dāng)M南芥基因組中有一個(gè)細(xì)菌IrgB基因的同源基因，稱之為AtLrgB。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，擬南芥基因組中許多編碼肽聚糖合成酶的基因是缺失的，因此擬南芥細(xì)胞中沒(méi)有肽聚糖結(jié)構(gòu)。同時(shí)，擬南芥中不存在編碼胞壁質(zhì)水解酶的基因，因此，AtLrgB基因在進(jìn)化過(guò)程中功能發(fā)生了改變。本研究通過(guò)對(duì)AtLrgB突變體和過(guò)量表達(dá)體的表型觀察和分析，闡述了AtLrgB基

2、因在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育中的功能。得到的主要結(jié)果如下：
　　 1．構(gòu)建了AtLrgB-EGFP融合蛋白來(lái)分析AtLrgB蛋白的亞細(xì)胞定位．結(jié)果表明，AtLrgB蛋白位于葉綠體內(nèi)膜上，同時(shí)，構(gòu)建了PAtLrgB:GUS啟動(dòng)子報(bào)告株系。GUS的組織化學(xué)染色結(jié)果表明AtLrgB基因主要在擬南芥的地上部分表達(dá)，在根中不表達(dá)．并且，GUS的表達(dá)主要集中在幼嫩的組織中，在成熟葉片中其表達(dá)從葉尖到葉片基部逐漸消失，表明AtLrgB基因的啟動(dòng)子受到的

3、調(diào)控類似于葉片從庫(kù)到源轉(zhuǎn)交的調(diào)控機(jī)制．對(duì)于AtLrgB基因在一個(gè)光周期內(nèi)表達(dá)量的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，AtLrgB基因的表達(dá)受到晝夜節(jié)律的調(diào)控．
　　 2．T-DNA插入突變體αtlrgB-1植株與AtLrgB-RNAi轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)出淺綠的子葉和幼葉．當(dāng)atlrgB-1突變體在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)到8天時(shí)，子葉的葉尖開(kāi)始出現(xiàn)壞死，并且逐漸擴(kuò)散，然后第一對(duì)真葉也出現(xiàn)壞死。將PAtLrgB:AtLrgB轉(zhuǎn)入突變體中進(jìn)行表型彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

4、，結(jié)果證明突變體的表型與AtLrgB基因的T-DNA插入直接相關(guān)．
　　 3．通過(guò)構(gòu)建35S:AtLrgB表達(dá)載體，獲得了AtLrgB過(guò)量表達(dá)的擬南芥轉(zhuǎn)基因純系。通過(guò)表型觀察，發(fā)現(xiàn)AtLrgB基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致了植株葉片萎黃和生長(zhǎng)遲緩。
　　 4．觀察了野生型、atlrgB-1突變體和過(guò)量表達(dá)體葉片的葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)。突變體和過(guò)量表達(dá)體的葉肉細(xì)胞中，葉綠體的類囊體結(jié)構(gòu)都表現(xiàn)出稀疏的現(xiàn)象．a(chǎn)tlrgB-1突變體葉綠體中的淀

5、粉粒比野生型中大，并且數(shù)量更多；而在過(guò)量表達(dá)體中，淀粉粒很少甚至消失．維管束鞘細(xì)胞中，atlrgB-I突變體的葉綠體基本正常，而過(guò)量表達(dá)體的葉綠體較小，并且類囊體結(jié)構(gòu)很少。
　　 5．測(cè)定了野生型、atlrgB-1突變體和過(guò)量表達(dá)體葉片的淀粉含量。結(jié)果表明突變體在白天比野生型累積了更多的淀粉，而過(guò)量表達(dá)體的淀粉累積量很少．同時(shí)，還測(cè)定了三種植株中蔗糖的含量。白天，突變體葉片中的蔗糖含量始終低于野生型；夜晚，突變體蔗糖含量先發(fā)生了

6、短暫的急劇增加，然后逐漸減少．對(duì)于過(guò)量表達(dá)體來(lái)說(shuō)，白天葉片中的蔗糖含量基本與野生型相等，只是在光周期的最后階段略高于野生型；夜晚時(shí)分葉片中的蔗糖含量始終低于野生型。
　　 6．研究了培養(yǎng)基中不同蔗糖濃度對(duì)于atlrgB-1突變體和AtLrgB基因過(guò)量表達(dá)體表型的影響。在2％蔗糖濃度培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的atlrgB-1突變體植株相較于1％蔗糖濃度培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的植株，其葉片壞死出現(xiàn)得遲，并且壞死區(qū)域較少．而過(guò)量表達(dá)體在2％蔗糖濃度培養(yǎng)基上

7、生長(zhǎng)時(shí)，表現(xiàn)出更嚴(yán)重的萎黃表型，同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)外源的葡萄糖對(duì)于突變體與過(guò)量表達(dá)體的影響類似于蔗糖。這些結(jié)果說(shuō)明突變體和過(guò)量表達(dá)體的異常表型與破水化合物的可獲得性是密切相關(guān)的．
　　 7、經(jīng)序列查找和比對(duì)，發(fā)現(xiàn)AtLrgB的同源蛋白在細(xì)菌和植物中是廣泛存在的．這些同源蛋白的LrgB結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，這一結(jié)構(gòu)域在細(xì)菌和植物中是高度保守的．同時(shí)，將植物中同源基因的N端序列與原核生物的LrgA結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了氨基酸序列的比對(duì)后發(fā)現(xiàn)

8、，這些基因的N末端與原核生物的LrgA結(jié)構(gòu)域具有相似性，盡管這種相似性比LrgB結(jié)構(gòu)域低．比對(duì)結(jié)果表明，從原核生物到真核生物的進(jìn)化過(guò)程中，LrgA和LrgB基因發(fā)生了基因融合。
　　 8．構(gòu)建了35S:AtLrgB-D1和35S:AtLrgB-D2過(guò)量表達(dá)體，表型觀察結(jié)果表明，單個(gè)LrgA結(jié)構(gòu)域與LrgB結(jié)構(gòu)域過(guò)量表達(dá)體都表現(xiàn)出35S:AtLrgB過(guò)量表達(dá)體的萎黃表型，同時(shí)，構(gòu)建了PAtLrgB:AtLrgB-D1和PAtLrg