人EBLN1基因系統(tǒng)進化分析及其生物學(xué)功能研究.pdf

1、背景：人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(human endogenous retroviruses，HERV)是在病毒感染過程中，其DNA整合到人類基因組并經(jīng)過長期遺傳而產(chǎn)生的。人類基因組中約8%的基因來自于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。HERV參與胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等多種人體正常生理功能。在分子水平上，HERV可通過多種方式參與基因表達調(diào)節(jié)，如啟動子、增強子或沉默子、多聚腺苷酸化信號、各種核蛋白結(jié)合位點。研究表明，HERV的異常表達與人類某些疾病的發(fā)生密切相關(guān)

2、，主要包括神經(jīng)精神疾病、癌癥和免疫性疾病。如HERV-W1在多種惡性腫瘤中呈高表達和異?；罨Ｒ蚨?，深入研究 HERV的生物學(xué)功能有利于揭示人類疾病的致病機制，HERV有望成為治療的新靶點。
　　EBLN(endogenous borna-like N elements)與博爾納病病毒(borna disease virus,BDV)核蛋白(P40)具有高度同源性的內(nèi)源性非逆轉(zhuǎn)錄病毒。迄今為止，在人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7個EBLNs

3、，分別命名為EBLN1～EBLN7。其中，EBLN1與BDV N蛋白氨基酸序列的同源性最高。目前人們對EBLN1的生物學(xué)功能了解甚少。
　　已證實，EBLN1不僅高表達于293T、MOLT4細胞，而且在少突膠質(zhì)(oligodendroglia,OL)細胞、神經(jīng)母細胞(SY5Y)、人膠質(zhì)瘤細胞(U87)等神經(jīng)腫瘤細胞中也呈高表達。提示EBLN1可能在維持神經(jīng)腫瘤的惡性表型中具有重要作用。
　　BDV是一種單股負鏈RNA病毒，包

4、含6個開放閱讀框(open reading frame,ORF)，至少表達6個病毒蛋白(N、P、X、L、G和M)，其中蛋白N(P40)和P(P23)是BDV致病的關(guān)鍵因子。BDV具有高度嗜神經(jīng)性，主要侵犯邊緣系統(tǒng)。動物實驗表明，BDV感染可引起宿主行為異常、情緒異常和學(xué)習(xí)記憶障礙。流行病學(xué)調(diào)查表明，BDV感染率在精神分裂癥、雙相情感障礙等神經(jīng)精神疾病的患者明顯高于正常對照組。BDV可能是人類神經(jīng)精神疾病的致病之一。由此推測，EBLN1的

5、生物學(xué)功能可能也與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。
　　目的：
　　1、在完成對5個BDV病毒株(Hu-H2、HUSA1、Dessau、Cresalo和WR3)全基因組測序的基礎(chǔ)上，分析EBLN1與人源性BDV N基因的系統(tǒng)進化關(guān)系。
　　2、觀察RNAi技術(shù)抑制EBLN1后OL細胞、SY5Y細胞、U87細胞生物特性的變化，以探討EBLN1在神經(jīng)腫瘤中的作用。
　　3、觀察EBLN1蛋白表達對海馬神經(jīng)元的影響及對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的

6、影響，以探討EBLN1蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中的生物學(xué)功能。
　　方法：
　　1、采用RT-PCR技術(shù)擴增5個BDV病毒株的全基因組序列；用DNAMAN軟件將5個病毒株全序列與從GenBank中獲取的BDV全長序列進行同源性比較；用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。同時進行EBLN1與人源性BDV N基因進行同源性比較和系統(tǒng)進化分析。
　　2、構(gòu)建EBLN1干擾慢病毒載體，感染OL細胞、SY5Y細胞、U87細胞，分別進行細胞增殖，凋

7、亡、細胞周期、體外克隆、劃痕和Transwell等實驗，以評價EBLN1干擾對神經(jīng)腫瘤細胞生物學(xué)特性的影響。qRT-PCR檢測EBLN1干擾對OL細胞基因表達的影響。Western blotting檢測周期和凋亡相關(guān)蛋白表達水平。
　　3、構(gòu)建EBLN1表達的慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體，分別感染海馬神經(jīng)元和大鼠海馬定位注射。免疫熒光檢測EBLN1蛋白的細胞定位?；蛐酒瑱z測EBLN1蛋白對神經(jīng)元基因表達的影響。Western bl

8、otting檢測突觸可塑料性相關(guān)蛋白的水平。水迷宮實驗評價大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。
　　結(jié)果：
　　1、來自不同宿主的5個BDV病毒株(Hu-H2、HUSA1、Dessau、Cressalo和 WR3)的全基因組擴增和測序。進一步分析得出，人源性BDV病毒株與非人源性病毒株之間的同源性為98.07～99.97%；人源性BDV病毒株在親緣關(guān)系上具有地域特征。此外，EBLN1與人源性BDV N基因的同源性為47.6%～50.82%，

9、并且與來自德國病人BDV N基因具有緊密的親緣關(guān)系。
　　2、EBLN1干擾能夠?qū)е翺L、SY5Y和U87細胞生物特性的改變，分別表現(xiàn)為：OL細胞增殖受抑、凋亡增加，體外克隆形成減少；SY5Y細胞運動遷徙能力減低；U87細胞增殖受抑、凋亡增加、體克隆形成減少，同時運動遷徙能力減低。EBLN1干擾OL細胞后，3個與膠質(zhì)細胞瘤的增殖和凋亡密切相關(guān)的基因RND3、OSMR和CREB3L2呈高表達。EBLN1干擾OL細胞后，凋亡抑制蛋白B

10、cl-2的表達明顯減低。而Bax、caspase3和P53的表達在EBLN1干擾前后無明顯差異。
　　3、EBLN1蛋白定位于胞漿。EBLN1蛋白在神經(jīng)元表達后，檢測到有顯著表達差異的基因170個，上調(diào)基因10個，如NEFM、CCDC148、GPR85等；下調(diào)基因160個，包括DES、ABCD5、GOLGA6C、ANXA2、PARP4等。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因的功能主要集中在細胞周期、RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體的固縮和分離等。KE

11、GG分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要與核糖體信號通路有關(guān)。同時，EBLN1蛋白可導(dǎo)致神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白PSD95和pERK的表達水平增加。然而，水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)EBLN1蛋白表達前后，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力無明顯影響。
　　結(jié)論：
　　1、人源性BDV病毒株與非人源性BDV病毒株之間具有很高的同源性。BDV病毒在親緣關(guān)系上具有地域性。EBLN1與人源性BDV病毒株具有緊密的親緣關(guān)系。
　　2、EBLN1干擾能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)腫瘤細胞的惡性表型