中國紅豆杉中JA信號(hào)調(diào)控紫杉醇生物合成模式研究.pdf

1、茉莉酸（Jasmonate，JA）是植物體中廣泛存在并且具有高效調(diào)節(jié)作用的內(nèi)源激素之一，尤其對(duì)萜類、生物堿類和黃酮類的次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成具有重要的調(diào)控作用。但由于JA信號(hào)激素能夠同時(shí)引起細(xì)胞凋亡等一系列副反應(yīng)，從而限制了其實(shí)際應(yīng)用。因此，通過闡釋JA信號(hào)通路調(diào)控植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的模式，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，不僅能夠提高目標(biāo)產(chǎn)物的含量，而且能夠有效地避免副反應(yīng)損害。紫杉醇是中國紅豆杉體內(nèi)一類重要的二萜類物質(zhì)，對(duì)于治療乳腺癌和卵

2、巢癌具有良好的療效。但是，由于其生物體內(nèi)含量低且合成步驟復(fù)雜，從而嚴(yán)重制約了其商業(yè)化生產(chǎn)。本文對(duì)中國紅豆杉中JA信號(hào)調(diào)控紫杉醇生物合成模式進(jìn)行研究，以期為構(gòu)建紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。
　　本文首先通過對(duì)中國紅豆杉中紫杉醇合成酶基因啟動(dòng)子上的順式作用元件進(jìn)行克隆和分析，然后以關(guān)鍵的JA信號(hào)響應(yīng)元件為誘餌，篩選與其相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，從而闡明JA信號(hào)通路調(diào)控紫杉醇合成的下游模式。同時(shí)，鑒定中國紅豆杉中的JA信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)JAZ

3、（Jasmonate-ZIM domain）和MYC2因子，以研究中國紅豆杉中JA信號(hào)通路上游響應(yīng)的調(diào)控方式及其與下游響應(yīng)之間的相互作用。結(jié)合以上結(jié)果，從而能夠闡明JA信號(hào)調(diào)控紫杉醇生物合成的模式。取得的主要結(jié)果如下：
　　(1)JA調(diào)控紫杉醇合成模式中的的靶點(diǎn)篩選。對(duì)TASY，T5H，T10H，T13H，TAT和T7H6個(gè)紫杉醇合成酶基因的啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆和研究，發(fā)現(xiàn)E-box，G-box和T/G-box等JA-responsi

4、ve順式作用元件廣泛存在于紫杉醇合成酶基因啟動(dòng)子上，表明MYC2是響應(yīng)JA信號(hào)并調(diào)控紫杉醇生物合成的重要轉(zhuǎn)錄因子。其中，紫杉醇合成酶TASY基因啟動(dòng)子與PR(Pathogen-Related)、STR（Strictosidine synthase）、PMT2（putrescine N-methyltransferase2）等JA響應(yīng)基因的啟動(dòng)子具有相同結(jié)構(gòu)，即近端分布的T/G-box及串聯(lián)的G-box和GCC-box順式作用元件，說明T

5、ASY是JA調(diào)控紫杉醇合成模式中的的重要靶點(diǎn)，同時(shí)也表明了ERF（Ethylene Responsive Factor）和MYC2轉(zhuǎn)錄因子在JA調(diào)控紫杉醇合成模式中具有重要作用。因此，本文以篩選調(diào)控TASY基因表達(dá)的ERF和MYC2為切入點(diǎn)，然后進(jìn)一步揭示兩類轉(zhuǎn)錄因子在JA信號(hào)調(diào)控紫杉醇合成模式中發(fā)揮的作用。
　　(2)與JRE元件相互作用的TcERFs的克隆與功能分析。啟動(dòng)子活性分析表明T/G-box、CGTCA-motif和G

6、CC-box是TASY基因響應(yīng)JA的功能元件，其中GCC-box發(fā)揮了最關(guān)鍵作用。根據(jù)GCC-box能夠特異與ERF類轉(zhuǎn)錄因子相互作用的特性，從中國紅豆杉轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得94個(gè)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其中23個(gè)蛋白序列具有ERF的特征堿基。分析MeJA處理前后兩個(gè)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，表達(dá)量發(fā)生顯著變化的有13個(gè)：其中4個(gè)表達(dá)量顯著上升，9個(gè)表達(dá)量顯著下調(diào)。利用序列分析等篩選得到兩個(gè)ERF類轉(zhuǎn)錄因子TcERF12和TcE

7、RF15，兩者分別編碼典型的B1和B3類GCC-box-binding ERF轉(zhuǎn)錄因子。酵母單雜交、紅豆杉細(xì)胞體內(nèi)共表達(dá)及超表達(dá)實(shí)驗(yàn)均表明，TcERF12和TcERF15能夠通過結(jié)合GCC-box而分別抑制和激活TASY基因的表達(dá)。
　　(3)JA信號(hào)途徑上游基因TcMYC2的克隆及功能驗(yàn)證。在中國紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選得到具有完整的MYC2轉(zhuǎn)錄因子特征結(jié)構(gòu)的TcMYC2，其蛋白序列與AtMYC2、NtMYC2和CrMYC2具有

8、極高的相似性，進(jìn)化分析也表明它們具有極近的親緣關(guān)系，意味著TcMYC2在紅豆杉中有相似的作用。TcMYC2與TASY啟動(dòng)子順式作用元件的相互作用實(shí)驗(yàn)證明，TcMYC2能夠與T/G-box、G-box相互作用并進(jìn)而激活TASY基因表達(dá)。而且，TcMYC2不僅能夠激活TASY，T5H，TAT，BAPT，T13H等紫杉醇合成酶基因，還能夠激活TcERF12和TcERF15的表達(dá)。以上結(jié)果表明，TcMYC2對(duì)于響應(yīng)JA信號(hào)并調(diào)控植物次級(jí)代謝產(chǎn)物

9、合成具有重要作用。
　　(4)JA信號(hào)途徑上游基因TcJAZ的克隆及功能驗(yàn)證。通過對(duì)紅豆杉中TcJAZ基因的研究發(fā)現(xiàn)，除Group V亞家族外，其他的JAZ蛋白在裸子植物與被子植物中具有不同的進(jìn)化路徑。因此，挑選Group V亞家族中的TcJAZ3作為研究紅豆杉中JA信號(hào)通路的目標(biāo)因子。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明，TcMYC2能夠與TcJAZ3相互作用，TcJAZ3能夠在紅豆杉體內(nèi)與TcMYC2結(jié)合從而抑制其活性。表明中國紅豆杉體內(nèi)同樣存