中國紅豆杉中JA信號調(diào)控紫杉醇生物合成模式研究.pdf

1、茉莉酸（Jasmonate，JA）是植物體中廣泛存在并且具有高效調(diào)節(jié)作用的內(nèi)源激素之一，尤其對萜類、生物堿類和黃酮類的次級代謝產(chǎn)物的生物合成具有重要的調(diào)控作用。但由于JA信號激素能夠同時引起細(xì)胞凋亡等一系列副反應(yīng)，從而限制了其實(shí)際應(yīng)用。因此，通過闡釋JA信號通路調(diào)控植物次級代謝產(chǎn)物的模式，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，不僅能夠提高目標(biāo)產(chǎn)物的含量，而且能夠有效地避免副反應(yīng)損害。紫杉醇是中國紅豆杉體內(nèi)一類重要的二萜類物質(zhì)，對于治療乳腺癌和卵

2、巢癌具有良好的療效。但是，由于其生物體內(nèi)含量低且合成步驟復(fù)雜，從而嚴(yán)重制約了其商業(yè)化生產(chǎn)。本文對中國紅豆杉中JA信號調(diào)控紫杉醇生物合成模式進(jìn)行研究，以期為構(gòu)建紫杉醇高產(chǎn)細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。
　　本文首先通過對中國紅豆杉中紫杉醇合成酶基因啟動子上的順式作用元件進(jìn)行克隆和分析，然后以關(guān)鍵的JA信號響應(yīng)元件為誘餌，篩選與其相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，從而闡明JA信號通路調(diào)控紫杉醇合成的下游模式。同時，鑒定中國紅豆杉中的JA信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)JAZ

3、（Jasmonate-ZIM domain）和MYC2因子，以研究中國紅豆杉中JA信號通路上游響應(yīng)的調(diào)控方式及其與下游響應(yīng)之間的相互作用。結(jié)合以上結(jié)果，從而能夠闡明JA信號調(diào)控紫杉醇生物合成的模式。取得的主要結(jié)果如下：
　　(1)JA調(diào)控紫杉醇合成模式中的的靶點(diǎn)篩選。對TASY，T5H，T10H，T13H，TAT和T7H6個紫杉醇合成酶基因的啟動子進(jìn)行了克隆和研究，發(fā)現(xiàn)E-box，G-box和T/G-box等JA-responsi

4、ve順式作用元件廣泛存在于紫杉醇合成酶基因啟動子上，表明MYC2是響應(yīng)JA信號并調(diào)控紫杉醇生物合成的重要轉(zhuǎn)錄因子。其中，紫杉醇合成酶TASY基因啟動子與PR(Pathogen-Related)、STR（Strictosidine synthase）、PMT2（putrescine N-methyltransferase2）等JA響應(yīng)基因的啟動子具有相同結(jié)構(gòu)，即近端分布的T/G-box及串聯(lián)的G-box和GCC-box順式作用元件，說明T

5、ASY是JA調(diào)控紫杉醇合成模式中的的重要靶點(diǎn)，同時也表明了ERF（Ethylene Responsive Factor）和MYC2轉(zhuǎn)錄因子在JA調(diào)控紫杉醇合成模式中具有重要作用。因此，本文以篩選調(diào)控TASY基因表達(dá)的ERF和MYC2為切入點(diǎn)，然后進(jìn)一步揭示兩類轉(zhuǎn)錄因子在JA信號調(diào)控紫杉醇合成模式中發(fā)揮的作用。
　　(2)與JRE元件相互作用的TcERFs的克隆與功能分析。啟動子活性分析表明T/G-box、CGTCA-motif和G

6、CC-box是TASY基因響應(yīng)JA的功能元件，其中GCC-box發(fā)揮了最關(guān)鍵作用。根據(jù)GCC-box能夠特異與ERF類轉(zhuǎn)錄因子相互作用的特性，從中國紅豆杉轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得94個AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其中23個蛋白序列具有ERF的特征堿基。分析MeJA處理前后兩個細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，表達(dá)量發(fā)生顯著變化的有13個：其中4個表達(dá)量顯著上升，9個表達(dá)量顯著下調(diào)。利用序列分析等篩選得到兩個ERF類轉(zhuǎn)錄因子TcERF12和TcE

7、RF15，兩者分別編碼典型的B1和B3類GCC-box-binding ERF轉(zhuǎn)錄因子。酵母單雜交、紅豆杉細(xì)胞體內(nèi)共表達(dá)及超表達(dá)實(shí)驗(yàn)均表明，TcERF12和TcERF15能夠通過結(jié)合GCC-box而分別抑制和激活TASY基因的表達(dá)。
　　(3)JA信號途徑上游基因TcMYC2的克隆及功能驗(yàn)證。在中國紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選得到具有完整的MYC2轉(zhuǎn)錄因子特征結(jié)構(gòu)的TcMYC2，其蛋白序列與AtMYC2、NtMYC2和CrMYC2具有

8、極高的相似性，進(jìn)化分析也表明它們具有極近的親緣關(guān)系，意味著TcMYC2在紅豆杉中有相似的作用。TcMYC2與TASY啟動子順式作用元件的相互作用實(shí)驗(yàn)證明，TcMYC2能夠與T/G-box、G-box相互作用并進(jìn)而激活TASY基因表達(dá)。而且，TcMYC2不僅能夠激活TASY，T5H，TAT，BAPT，T13H等紫杉醇合成酶基因，還能夠激活TcERF12和TcERF15的表達(dá)。以上結(jié)果表明，TcMYC2對于響應(yīng)JA信號并調(diào)控植物次級代謝產(chǎn)物

9、合成具有重要作用。
　　(4)JA信號途徑上游基因TcJAZ的克隆及功能驗(yàn)證。通過對紅豆杉中TcJAZ基因的研究發(fā)現(xiàn)，除Group V亞家族外，其他的JAZ蛋白在裸子植物與被子植物中具有不同的進(jìn)化路徑。因此，挑選Group V亞家族中的TcJAZ3作為研究紅豆杉中JA信號通路的目標(biāo)因子。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明，TcMYC2能夠與TcJAZ3相互作用，TcJAZ3能夠在紅豆杉體內(nèi)與TcMYC2結(jié)合從而抑制其活性。表明中國紅豆杉體內(nèi)同樣存