產(chǎn)紫杉醇的紅豆杉內(nèi)生真菌研究.pdf

1、本論文以紅豆杉及其內(nèi)生真菌為主要試驗材料，對產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌進行了定性和定量分析，同時根據(jù)紫杉醇合成途徑中的關(guān)鍵酶首次討論了其遺傳學基礎(chǔ)，并建立了一種快速經(jīng)濟的篩選產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的方法。VHB(Vitreoscillahemoglobin透明顫菌血紅蛋白)基因成功電轉(zhuǎn)化其中一株內(nèi)生真菌。構(gòu)建出在厭氧或限氧條件下生長速度顯著加快的轉(zhuǎn)基因的工程菌，這對于發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)紫杉醇來說具有良好的應(yīng)用價值。 1紅豆杉內(nèi)生真菌的分離與純化

2、 將采集的紅豆杉枝條表面消毒后，置于含MS培養(yǎng)基的三角瓶中，待內(nèi)生真菌長出后，挑取尖端菌絲置于含CYM培養(yǎng)基的平板中，待長滿平板后，挑尖端菌絲置于另一含CYM培養(yǎng)基的平板中，如此重復5遍以上，即得到純化的內(nèi)生真菌菌株。 2產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的鑒定 將篩選到的內(nèi)生真菌用傳統(tǒng)的TLC，HPLC方法進行鑒定，得到三株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌，并進行了定量分析，紫杉醇產(chǎn)量分別達到8.5，31.5，31.1μg/L。根據(jù)真核生物18

3、SrDNA序列保守區(qū)設(shè)計了一對引物，對三株內(nèi)生真菌的形態(tài)及擴增得到的18SrDNA片段序列進行測定和BLAST分析，初步將它們鑒定為Fusarium(屬)和Pestalotiopsis(屬)。3紅豆杉內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇相關(guān)基因BAPT(C-13phenylpropanoidsidechain-CoAacyltransferaseC-13苯丙氨酸側(cè)鏈輔酶A?；D(zhuǎn)移酶)的鑒定及初步研究根據(jù)BAPT基因保守區(qū)設(shè)計引物，在內(nèi)生真菌及其宿主中PCR

4、擴增得到相應(yīng)片斷，序列測定及BLAST分析，表明來自內(nèi)生真菌的BAPT基因片段序列與紅豆杉BAPT基因片段具有非常高的相似性，因此我們推測，紅豆杉內(nèi)生真菌之所以能夠合成紫杉醇，是由于從其宿主中攝取了紫杉醇合成途徑中的酶的基因，即其遺傳學起源是基因轉(zhuǎn)移而不是共進化。同時也建立了一種快速經(jīng)濟的鑒定產(chǎn)紫杉醇真菌的輔助方法。 4電轉(zhuǎn)化對真菌的基因改良 將由實驗室構(gòu)建的質(zhì)粒PBG1V(以除草劑為抗性基因，GUS為報告基因，將VHB