寡聚半乳糖醛酸對云南紅豆杉細胞紫杉醇生物合成的誘導研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、紫杉醇是紅豆杉屬植物活性紫杉烷類次生代謝產(chǎn)物的代表之一,是具有獨特作用機制的有效抗癌新藥,10-去乙?;涂ㄍあ?10-deaeety1 baecatin Ⅲ,10-DABⅢ)則為紫杉醇的合成前體,同時自身亦具有生物活性。然而兩者的來源緊缺,目前采用離體培養(yǎng)紅豆杉細胞生產(chǎn)紫杉烷類活性成分已成為研究熱點。應用植物對生物誘導物的超敏反應機理,本文以寡聚半乳糖醛酸(Oligogalacturonides,OGA)為誘導物,研究其對云南紅豆杉(

2、Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu.)懸浮培養(yǎng)細胞中紫杉醇及10-DABⅢ產(chǎn)量的調(diào)控,并對誘導的機制作了初步探討。 首先,建立了同步測定云南紅豆杉細胞中紫杉醇和10-DABⅢ含量的HPLC方法,在232衄檢測波長下以甲醇-乙腈-水(2:3:8)為流動相等度洗脫,10-DABⅢ得到良好的分離,在0.0515~2.06μg與峰面積線性關(guān)系良好,方程Y=89.146X+27.067(R2=0.9996)

3、,細胞及培養(yǎng)液供試品平均回收率分別為94.96%、100.72%,RSD分別為0.44%、O.81%。本方法簡便可靠,重現(xiàn)性好,靈敏度高。 應用果膠酶處理多聚半乳糖醛酸,制備細胞培養(yǎng)誘導物。多聚半乳糖醛酸在室溫下酶解20 min,得到不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸,再經(jīng)Sephadex G-10(Mw≥700)柱處理,制備得到平均聚合度為13.231的OGA誘導子。 為明確OGA對云南紅豆杉細胞的最佳誘導條件,以紫杉醇及10

4、-DABⅢ產(chǎn)量為目標,分別對OGA誘導子的最佳處理時間、最佳處理濃度,及細胞的最佳收獲時間等方面進行考察,篩選出OGA誘導最佳條件為:40μg/mL OGA處理懸浮培養(yǎng)至第12天的云南紅豆杉細胞,處理后第3天收獲細胞,紫杉醇及10-DAB M產(chǎn)量可分別達到O.51 mg/L及0.98 mg/L,與對照組(O.13 mg/t,及O.27 mg/L)相比分別增加了2.92與2.62倍,表明OGA是誘導云南紅豆杉細胞中紫杉醇及10-DABⅢ的

5、較佳誘導子。 對OGA誘導下云南紅豆杉細胞的凋亡現(xiàn)象進行了探討。通過AO/EB染色法、TUNEL法、DNA梯狀電泳等方法證實OGA可誘導云南紅豆杉細胞發(fā)生細胞凋亡AO/EB染色法計數(shù)細胞凋亡率,發(fā)現(xiàn)隨著OGA誘導時間的延長,凋亡細胞增多,在處理24 h后凋亡率達到28.5%。TUNEL法檢測顯示細胞凋亡程度隨OGA誘導時間的延長呈現(xiàn)增多趨勢。DNA梯狀電泳圖譜表明了OGA誘導紅豆杉細胞第3天產(chǎn)生了梯狀條帶,細胞發(fā)生了大量凋亡。

6、 對OGA誘導下云南紅豆杉細胞的氧化還原態(tài)勢變化進行了分析。OGA可誘導云南紅豆杉細胞以H202為主的活性氧進發(fā)并影響到紫杉烷類次生代謝物的產(chǎn)量變化。OGA可誘導云南紅豆杉細胞1.5~2 h H2O2達到分泌高峰(17.95 μuol/L),H202分泌迅速增加而持續(xù)時間相對較短(約2 h)。同時,經(jīng)OGA處理后,超氧化物歧化酶(SOD)在2 h出現(xiàn)了高峰值,與此同時過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)則受到了強烈的抑制,多

7、酚氧化酶(PPO)活性同樣得到提高。紅豆杉細胞經(jīng)OGA處理后,苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)活性明顯升高,第2 d達到峰值(39.01U/h mg proteill),用CAT與二苯基碘(DPI)分別直接、間接抑制H202的產(chǎn)生,與OGA誘導組相比,PAL活性與紫杉烷類產(chǎn)量則受到了顯著的抑制。細胞內(nèi)維持一定水平H202是云南紅豆杉細胞紫杉醇及10-DABⅢ生物合成的一個重要因素,H202為主的ROS進發(fā)致使細胞凋亡,進而引起紫杉醇及10-DA

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