寡聚半乳糖醛酸對云南紅豆杉細胞紫杉醇生物合成的誘導研究.pdf

1、紫杉醇是紅豆杉屬植物活性紫杉烷類次生代謝產(chǎn)物的代表之一，是具有獨特作用機制的有效抗癌新藥，10-去乙?；涂ㄍあ?10-deaeety1 baecatin Ⅲ，10-DABⅢ)則為紫杉醇的合成前體，同時自身亦具有生物活性。然而兩者的來源緊缺，目前采用離體培養(yǎng)紅豆杉細胞生產(chǎn)紫杉烷類活性成分已成為研究熱點。應用植物對生物誘導物的超敏反應機理，本文以寡聚半乳糖醛酸(Oligogalacturonides，OGA)為誘導物，研究其對云南紅豆杉(

2、Taxus yunnanensis Cheng et L．K．Fu．)懸浮培養(yǎng)細胞中紫杉醇及10-DABⅢ產(chǎn)量的調(diào)控，并對誘導的機制作了初步探討。 首先，建立了同步測定云南紅豆杉細胞中紫杉醇和10-DABⅢ含量的HPLC方法，在232衄檢測波長下以甲醇-乙腈-水(2：3：8)為流動相等度洗脫，10-DABⅢ得到良好的分離，在0.0515～2.06μg與峰面積線性關(guān)系良好，方程Y=89.146X+27.067(R2=0.9996)

3、，細胞及培養(yǎng)液供試品平均回收率分別為94.96％、100.72％，RSD分別為0.44％、O．81％。本方法簡便可靠，重現(xiàn)性好，靈敏度高。 應用果膠酶處理多聚半乳糖醛酸，制備細胞培養(yǎng)誘導物。多聚半乳糖醛酸在室溫下酶解20 min，得到不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸，再經(jīng)Sephadex G-10(Mw≥700)柱處理，制備得到平均聚合度為13.231的OGA誘導子。 為明確OGA對云南紅豆杉細胞的最佳誘導條件，以紫杉醇及10

4、-DABⅢ產(chǎn)量為目標，分別對OGA誘導子的最佳處理時間、最佳處理濃度，及細胞的最佳收獲時間等方面進行考察，篩選出OGA誘導最佳條件為：40μg/mL OGA處理懸浮培養(yǎng)至第12天的云南紅豆杉細胞，處理后第3天收獲細胞，紫杉醇及10-DAB M產(chǎn)量可分別達到O．51 mg／L及0.98 mg／L，與對照組(O．13 mg／t,及O．27 mg/L)相比分別增加了2.92與2.62倍，表明OGA是誘導云南紅豆杉細胞中紫杉醇及10-DABⅢ的

5、較佳誘導子。 對OGA誘導下云南紅豆杉細胞的凋亡現(xiàn)象進行了探討。通過AO／EB染色法、TUNEL法、DNA梯狀電泳等方法證實OGA可誘導云南紅豆杉細胞發(fā)生細胞凋亡AO／EB染色法計數(shù)細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)隨著OGA誘導時間的延長，凋亡細胞增多，在處理24 h后凋亡率達到28.5％。TUNEL法檢測顯示細胞凋亡程度隨OGA誘導時間的延長呈現(xiàn)增多趨勢。DNA梯狀電泳圖譜表明了OGA誘導紅豆杉細胞第3天產(chǎn)生了梯狀條帶，細胞發(fā)生了大量凋亡。

6、 對OGA誘導下云南紅豆杉細胞的氧化還原態(tài)勢變化進行了分析。OGA可誘導云南紅豆杉細胞以H202為主的活性氧進發(fā)并影響到紫杉烷類次生代謝物的產(chǎn)量變化。OGA可誘導云南紅豆杉細胞1.5～2 h H2O2達到分泌高峰(17.95 μuol/L)，H202分泌迅速增加而持續(xù)時間相對較短(約2 h)。同時，經(jīng)OGA處理后，超氧化物歧化酶(SOD)在2 h出現(xiàn)了高峰值，與此同時過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)則受到了強烈的抑制，多

7、酚氧化酶(PPO)活性同樣得到提高。紅豆杉細胞經(jīng)OGA處理后，苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)活性明顯升高，第2 d達到峰值(39.01U/h mg proteill)，用CAT與二苯基碘(DPI)分別直接、間接抑制H202的產(chǎn)生，與OGA誘導組相比，PAL活性與紫杉烷類產(chǎn)量則受到了顯著的抑制。細胞內(nèi)維持一定水平H202是云南紅豆杉細胞紫杉醇及10-DABⅢ生物合成的一個重要因素，H202為主的ROS進發(fā)致使細胞凋亡，進而引起紫杉醇及10-DA