紅豆杉細(xì)胞合成紫杉醇的分子調(diào)控機(jī)理.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文紅豆杉細(xì)胞合成紫杉醇的分子調(diào)控機(jī)理姓名：李麗琴申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：生物制藥工程指導(dǎo)教師：余龍江20090501華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文II紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量下降?；蚪MDNA序列比較穩(wěn)定，但是出現(xiàn)了DNA甲基化水平和模式的顯著變化。在低激素濃度培養(yǎng)基上長(zhǎng)期離體培養(yǎng)的紅豆杉細(xì)胞的遺傳變異現(xiàn)象與之相反。說(shuō)明植物激素作用可能是影響紅豆杉細(xì)胞長(zhǎng)期離體培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生遺傳變異的因素之一，

2、且與高激素條件下引起的細(xì)胞中DNA甲基化水平變異密切相關(guān)。低溫緩慢生長(zhǎng)法培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞可以減少紅豆杉細(xì)胞在長(zhǎng)期離體培養(yǎng)過(guò)程中的傳代次數(shù)，但在恢復(fù)培養(yǎng)過(guò)程中仍發(fā)生了遺傳變異：紅豆杉細(xì)胞分別在低溫保存30d、60d、180d和1a后恢復(fù)培養(yǎng)30d、60d、180d過(guò)程中，隨著紫杉醇和紫杉烷含量的改變，紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)譜、基因組DNA序列穩(wěn)定性、DNA甲基化水平和模式均發(fā)生了相應(yīng)的改變，其中，DNA甲基化水平的變異與紫杉醇含量的改變

3、密切相關(guān)。上述研究結(jié)果均證明紫杉醇含量與DNA甲基化水平始終密切相關(guān)。外源添加5AzaCdR，能抑制紅豆杉DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(CMT)的活性，降低紅豆杉DNA甲基化水平，提高紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，從而提高細(xì)胞合成紫杉醇的能力。在相同的傳代次數(shù)和培養(yǎng)條件下，同步化處理能有效控制部分小細(xì)胞團(tuán)引起的紫杉醇合成能力發(fā)生變化的現(xiàn)象。研究表明未經(jīng)低溫同步化的紅豆杉細(xì)胞中的關(guān)鍵酶基因DXR、HMGR、GGPPS和DBAT的表達(dá)量在MJ誘導(dǎo)24h后

4、均迅速下降，但在低溫同步化的細(xì)胞中DBAT基因表達(dá)量增加，4個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量下降減緩，誘導(dǎo)60h后仍維持較高水平。說(shuō)明DBAT基因表達(dá)量增加以及一系列其他紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因在轉(zhuǎn)錄水平的高效持續(xù)表達(dá)是同步化穩(wěn)定提高紫杉醇產(chǎn)量的主要分子機(jī)理之一。紅豆杉細(xì)胞在離體培養(yǎng)過(guò)程中，紫杉醇生物合成能力受到合成紫杉醇關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。DNA甲基化去甲基化模式可能是啟動(dòng)關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄的“開(kāi)關(guān)”，從而表現(xiàn)為DNA甲基化水平與與紫杉醇合成能力的密