GalectiN-1介導(dǎo)NFs向CAFs轉(zhuǎn)化與胃癌apatinib敏感性的關(guān)系的研究.pdf

1、胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居第四，腫瘤相關(guān)死亡率位居第二。腫瘤血管形成促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，VEGF/VEGFR信號(hào)通路在腫瘤血管生成中起主導(dǎo)作用。因此抗腫瘤血管生成治療多以VEGF/VEGFR為靶點(diǎn)。Apatinib作為VEGFR抑制劑，晚期胃癌患者接受apatinib治療使生存獲益，但是缺乏能夠預(yù)測(cè)apatinib獲益人群的生物標(biāo)志物。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CA

2、Fs）分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤血管生成。Galectin-1在腫瘤細(xì)胞和CAFs中均可表達(dá)。近年來，多項(xiàng)研究報(bào)道galectin-1通過多種途徑促進(jìn)腫瘤血管生成。然而，galectin-1在CAFs中表達(dá)與胃癌apatinib敏感性的關(guān)系，目前尚無報(bào)道。
　　第一部分：
　　目的：腫瘤進(jìn)展是腫瘤細(xì)胞和CAFs相互促進(jìn)的結(jié)果，腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如TGF-β等，誘導(dǎo)正常成纖維細(xì)胞（normal fibroblasts，NFs

3、）向CAFs轉(zhuǎn)化，而CAFs活化后促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Galectin-1在腫瘤細(xì)胞和CAFs均可表達(dá)。目前galectin-1/TGF-β信號(hào)軸在腫瘤細(xì)胞與CAFs相互促進(jìn)過程中所起的中介作用尚不清楚，因此我們將對(duì)galectin-1/TGF-β在腫瘤細(xì)胞與CAFs間所起的聯(lián)系進(jìn)行探索。
　　方法：分離原代胃癌CAFs和NFs，并應(yīng)用免疫熒光和western blotting進(jìn)行鑒定。應(yīng)用real-time PCR和western b

4、lotting比較CAFs和NFs中g(shù)alectin-1的表達(dá)水平。利用galectin-1過表達(dá)的慢病毒載體感染NFs上調(diào)galectin-1表達(dá)(NFs-Gal1)，Smallinterfering RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染CAFs沉默galectin-1表達(dá)(CAFs-siGal1)。通過腫瘤細(xì)胞上清液誘導(dǎo)NFs向CAFs轉(zhuǎn)化的模型，探索galectin-1/TGF-β信號(hào)軸在腫瘤細(xì)胞與CAFs相互作用中的聯(lián)系。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)

5、胃癌組織中g(shù)alectin-1、TGF-β的表達(dá)情況，明確galectin-1與TGF-β的關(guān)聯(lián)。Kaplan-Meier曲線描述胃癌患者的生存期，并采用Log-rank檢驗(yàn)對(duì)臨床資料和數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Cox regression風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)胃癌預(yù)后的各臨床參數(shù)進(jìn)行多因素分析。
　　結(jié)果：Galectin-1在CAFs中高表達(dá)，并且促進(jìn)NFs向CAFs轉(zhuǎn)化。腫瘤細(xì)胞分泌TGF-β誘導(dǎo)NFs表達(dá)galectin-1，galect

6、in-1正向調(diào)節(jié)TGF-β誘發(fā)的NFs向CAFs轉(zhuǎn)化。Galectin-1表達(dá)與TGF-β表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.765，P＜0.001）。Galectin-1表達(dá)水平與腫瘤分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度和腫瘤TNM分期有關(guān)。Galectin-1高表達(dá)的胃癌患者總生存期短，并且是獨(dú)立的預(yù)后因素。
　　結(jié)論：Galectin-1促進(jìn)TGF-β所誘導(dǎo)的NFs向CAFs轉(zhuǎn)化的過程，并且其表達(dá)水平與胃癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。
　　第二部分

7、：
　　目的：第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CAFs中g(shù)alectin-1表達(dá)升高，并且galectin-1表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。我們將通過一系列的體外體內(nèi)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)探索galectin-1促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制。
　　方法：通過不同Galectin-1表達(dá)水平的成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CMs)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)C)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡， transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移。Wes

8、tern blotting等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行探討。建立裸鼠皮下荷瘤模型，明確成纖維細(xì)胞galectin-1表達(dá)水平對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　結(jié)果：CAFs明顯抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)侵襲和遷移(P＜0.05)。沉默CAFs中g(shù)alectin-1表達(dá)，抗腫瘤細(xì)胞凋亡及促侵襲的作用被逆轉(zhuǎn)。CAFs促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中Bcl-2和MMP9表達(dá)，抑制Bax表達(dá)。裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，galectin-1高表達(dá)的成纖維細(xì)胞明顯促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

9、r>　　結(jié)論：Galectin-1高表達(dá)的CAFs通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白和MMP9的表達(dá)水平，分別影響腫瘤細(xì)胞凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程。
　　第三部分：
　　目的：Apatinib靶向VEGFR，使晚期胃癌患者的生存顯著獲益，但是缺乏能夠預(yù)測(cè)apatinib療效的生物標(biāo)志物。Galectin-1在腫瘤血管生成中起重要作用，因此，我們將明確galectin-1表達(dá)水平與胃癌apatinib敏感性的關(guān)系。
　　方法：通過CCK

10、-8及體外HUVEC小管形成實(shí)驗(yàn)，探索CAFs中g(shù)alectin-1的表達(dá)水平與apatinib敏感性的關(guān)系。NFs-Gal1、NFs-Ctr分別與腫瘤細(xì)胞共同接種，建立裸鼠皮下荷瘤模型，從體內(nèi)水平評(píng)價(jià)apatinib的療效。
　　結(jié)果：Galectin-1促進(jìn)CAFs表達(dá)bFGF，使apatinib抑制HUVEC增殖及小管形成的作用受限。上調(diào)NFs中g(shù)alectin-1表達(dá)能夠抑制apatinib抗腫瘤生長(zhǎng)及抗血管生成的作用。<