FBXO31介導(dǎo)Snail1泛素化降解抑制胃癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、研究背景:
　　胃癌(GC)是世界常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在癌癥相關(guān)死亡中位居第三位，我國(guó)是胃癌高發(fā)區(qū)。胃癌患者生存期短、易復(fù)發(fā)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是造成胃癌預(yù)后差的重要原因。目前認(rèn)為上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，過(guò)程中有多種轉(zhuǎn)錄因子(EMT-TFs)的參與，這些EMT-TFs是高度不穩(wěn)定的蛋白，易被蛋白酶體途徑泛素化降解。
　　FBXO31是F-box蛋白家族成員，參與Skp1-Cullin-F-

2、box(SCF)泛素E3連接酶復(fù)合物的形成，能夠介導(dǎo)泛素依賴性蛋白酶體降解途徑和調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中FBXO31的mRNA和蛋白水平明顯降低，且低表達(dá)與胃癌患者預(yù)后差、存活期限短等密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO31高表達(dá)能夠顯著抑制人胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力，但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　研究目的:
　　1.探究FBXO31對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控機(jī)制;
　　2.探討FBXO31能否通

3、過(guò)泛素化依賴性途徑降解EMT-TFs，并確定FBXO31與EMT-TFs間相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.分子及細(xì)胞水平的研究
　　1.1.人胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染FBXO31 siRNA，觀察細(xì)胞表型變化。然后，將FBXO31 siRNA及高表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FBXO31干擾和高表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　1.2.FBXO31 siRNA和

4、高表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞，qRT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中不同EMT-TFs在mRNA和蛋白水平的變化。
　　1.3.將FBXO31表達(dá)載體Myc-FBXO31及F-box結(jié)構(gòu)域缺失的載體Myc-△FBXO31分別與EMT-TF Snail1的表達(dá)載體Flag-Snail1共轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，Western blot和Co-IP檢測(cè)FBXO31與Snail1的相互作用，并通過(guò)泛素化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FBXO31能否引起Sn

5、ail1的泛素化降解。
　　1.4.Myc-FBXO31高表達(dá)載體分別與Flag-Snail1的野生型和磷酸化位點(diǎn)突變的載體共轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，Co-IP檢測(cè)Snail1的降解是否需要發(fā)生磷酸化。
　　2.動(dòng)物水平的研究
　　構(gòu)建篩選FBXO31高表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系(BGC-FBXO31)，對(duì)裸鼠尾靜脈注射，6周后觀察并分析裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的情況。
　　3.臨床標(biāo)本的研究
　　收集77例人胃癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織，Wes

6、tern blot檢測(cè)組織中FBXO31與Snail1的表達(dá)并分析二者的相關(guān)性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.分子及細(xì)胞水平
　　1.1.胃癌細(xì)胞FBXO31干擾后細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間粘著性降低。細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)BXO31沉默能促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，F(xiàn)BXO31高表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　1.2.FBXO31 siRNA和高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，EMT-TF Snail1在mRN

7、A水平?jīng)]有變化，在蛋白水平可被FBXO31下調(diào)。
　　1.3.Co-IP結(jié)果顯示FBXO31能與Snail1相互結(jié)合，且F-box結(jié)構(gòu)域?qū)τ诙叩南嗷プ饔檬潜匦璧?，體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FBXO31能引起Snail1的泛素化，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FBXO31與Snail1的相互作用依賴于Snail1的磷酸化。
　　2.動(dòng)物水平的研究
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明高表達(dá)的FBXO31能顯著抑制裸鼠體內(nèi)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　3.臨

8、床標(biāo)本的研究
　　Western blot結(jié)果顯示:與癌旁組織相比，胃癌組織中FBXO31顯著低表達(dá)，而Snail1顯著高表達(dá)，二者在胃癌組織中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　研究結(jié)果表明，F(xiàn)BXO31能夠泛素化降解EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail1，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。在二者的相互作用中，F(xiàn)BXO31的F-box結(jié)構(gòu)域和Snail1的GSK-3β磷酸化基序是不可或缺的。該研究闡明了FBXO31抑制胃