納米金棒-MUC1適配體復合物的構建及其靶向識別研究.pdf

1、【研究背景】
　　肺癌是危害人類生命健康的常見疾病，其發(fā)病率和死亡率高居常見腫瘤之首。大部分肺癌患者因癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時多已進展至晚期，傳統(tǒng)放療、化療等手段治療效果不佳，新興的靶向藥物及免疫調定點阻滯劑在肺癌患者治療中表現(xiàn)出持續(xù)獲益，但均存在其局限性，在肺癌的診斷及治療領域要有新的突破需尋求新的靶向治療策略。納米金棒（AuNRs）具有獨特的生物相容性、表面修飾和功能化、高通透性和滯留效應(enhanced permeability

2、 and retention,EPR)、表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)、光熱轉換效應等理化及生物性質，在腫瘤診斷和治療領域展示出巨大應用前景,通常將表面修飾的AuNRs結合靶向分子構建具有主動靶向功能的AuNRs復合載體廣泛應用于分子成像、靶向載藥、放療增敏、光熱治療等腫瘤診斷及治療領域。核酸適配體是一種通過指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進化技術(Systematic Evolution of Lig

3、ands by Exponential Enrichment,SELEX)從隨機單鏈核酸序列庫中逐層篩選擴增出的能特異性與靶標結合的小片段DNA或RNA，與傳統(tǒng)抗體相比，具有高親和性、免疫原性弱、易于大規(guī)模合成、易于體外修飾、易于穿透腫瘤組織等性質，成為理想的靶標分子。黏蛋白-1(Mucin-1，MUC1)是一種分布在呼吸道、腺體導管、胃腸道等上皮細胞表面的高度糖基化黏蛋白，研究已表明它與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細胞生長、腫瘤細胞遷移等過程密切

4、相關，發(fā)生癌變時在細胞表面異常高表達，且暴露其核心肽上的相關抗原表位，使其成為一種廣譜靶標分子。為充分發(fā)揮AuNRs和核酸適配子的高效性，可考慮通過SELEX技術篩選出能與肺癌細胞表面高表達的MUC1蛋白具有高度親和性的MUC1適配體(MUC1-aptamer)，并將MUC1適配體與表面修飾的AuNRs連接構建一種新的具有主動靶向功能的復合物，應用于肺癌的早期診斷及治療領域的研究，探究肺癌細胞對這種復合物的攝取機制，并在此基礎上進行靶向

5、藥物運載、在人體組織投射窗口予近紅外激光照射等相關的靶向殺傷研究，以期為肺癌的新型靶向診療平臺提供理論基礎，為肺癌的早期診斷和治療提供新的思路。
　　【研究目的】
　　1.如何通過嚴格控制實驗條件，調節(jié)納米金粒子縱橫比以合成在525nm和近800nm波長處具有雙SPR峰的AuNRs；
　　2.篩選并合成能與肺癌A549細胞系表面高表達的MUC1蛋白具有高度親和的MUC1-aptamer；
　　3.在成功合成前兩步

6、目標物質基礎上構建具有主動靶向功能的AuNRs/MUC1-aptamer復合物；
　　4.探究所構建的新型靶向AuNRs/MUC1-aptamer復合物與高表達MUC1蛋白的肺癌A549細胞系結合、攝取特點，對比納米金棒被動靶向性的優(yōu)勢所在；
　　5.探究給予人體組織投射窗口的近紅外激光照射對靶向結合AuNRs/MUC1-aptamer復合物的A549細胞的特異性殺傷效應。
　　【研究方法】
　　1．改變AgNO

7、3、CTAB、抗壞血酸(ascorbicacid,AA)的濃度，調整納米金粒子縱橫比，通過金種子法誘導生長法(Seed-mediated growthmethods)合成在525nm和近800nm波長處具有雙向SPR峰的AuNRs，并進一步通過紫外分光法測定驗證，所得AuNRs置于4℃保存?zhèn)溆茫?br>　　2.選取對MUC1蛋白核心肽具有高親和性的適配體S2.2作為目標MUC1核酸適配體，并在單鏈MUC1-aptamer的5’端修飾巰基

8、以結合AuNRs，在3’端修飾6’-FAM熒光基團作為特異性結合靶細胞的檢測標記，通過質譜檢測驗證合成目標適配體的序列正確性及純度；
　　3.通過納米金棒的快速修飾法(rapid modification at low pH。RMLP)高效快速地將合成的巰基化MUC1-aptamer修飾連接AuNRs，并使用納米金比色法、紫外分光法對所構建的AuNRs/MUC1-aptamer復合物的物理特性進行表征及驗證；
　　4.將所構

9、建的AuNRs/MUC1-aptamer復合物分別與傳代培養(yǎng)的肺癌A549細胞系及對照組肝癌HepG2細胞系孵育，流式細胞儀檢測及熒光顯微鏡觀察復合物與細胞的靶向結合與攝入，細胞表面熒光強度代表靶向復合物結合細胞的效率；
　　5.利用AuNRs的近紫外區(qū)吸收峰及光熱轉換特性，使用近紅外光分別對與AuNRs/MUC1-aptamer復合物和AuNRs孵育后的靶細胞進行照射，并使用MTT比色法檢測對腫瘤細胞的殺傷效應，細胞存活率的大小

10、與其孵育的藥物毒性相關。
　　【結果】
　　金種子誘導生長法所合成納米金棒通過紫外分光光度計法檢測其紫外吸收波譜，在波長525nm和近800nm近紅外光處可見雙重等離子共振峰，即為目標所需AuNRs；將合成的巰基化MUC1-aptamer通過快速修飾法對AuNRs進行修飾，合成AuNRs/MUC1-aptamer復合物，通過納米金的比色法和紫外分光光度計法檢測紫外吸收波譜，可知靶向復合物構建成功，且該靶向復合物在波長525n

11、m和近800nm近紅外光處仍有可見雙重等離子共振峰；構建的AuNRs/MUC1-aptamer復合物與A549細胞孵育后使用熒光顯微鏡觀察細胞表面熒光強度顯著高于其他各組，同時使用流式細胞儀定量檢測細胞表面熒光強度，其熒光強度是AuNRs處理對照組5倍，差異顯著，在肝癌HepG2細胞系未見明顯差異，認為構建的靶向復合物與肺癌A549細胞系表現(xiàn)為特異性結合；分別與AuNRs/MUC1-aptamer復合物、AuNRs孵育的靶細胞經近紅外光

12、照射后，MTT比色法測定吸光值并算出各組細胞存活率，得出靶向復合物組+A549細胞組較陰性對照組及HepG2細胞系對照組細胞存活率明顯降低，差異顯著(P<0.05)。
　　【結論】
　　綜合分析本課題各部分結果得出：本研究成功構建了基于AuNRs和MUC1-aptamer結合的AuNRs/MUC1-aptamer復合物，該靶向復合物具有AuNRs的物理化學特性和適配子的靶向性，并能對細胞表面過表達MUC1蛋白的肺癌A549細