載siRNA納米復合物的構建和體外評價.pdf

1、目的：
　　近年來，RNA干擾在基因功能和基因治療方面的研究較為廣泛，已逐漸發(fā)展為一種較成熟的技術。RNA干擾是一種特異性細胞后轉(zhuǎn)錄機制，通過誘發(fā)相應mRNA的酶降解發(fā)揮基因沉默作用。雙鏈小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）是RNA干擾的效應分子之一，理論上可抑制任何靶基因表達，已被列為基因型疾病的潛在治療劑。但是，裸露的siRNA進入血清易被核酸酶降解，且siRNA帶負電荷，親水性強，導致其不易

2、透過細胞膜進入細胞質(zhì)發(fā)揮高效的RNAi作用。因此，siRNA應用的關鍵在于尋找安全、有效的遞送載體。目前已有很多載體用于改善siRNA的核酸酶抗性而又不干擾其沉默效率。其中，細胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）作為基因遞送載體被廣泛研究且表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢。細胞穿膜肽通常由5~30個氨基酸構成，是一類能攜帶大分子物質(zhì)進入細胞的陽離子或兩親性短肽。它可將不同的貨物分子轉(zhuǎn)運到細胞和組織中而不引起顯著毒副作

3、用。
　　本文擬構建一種可以包載核酸類藥物siRNA并提高其轉(zhuǎn)染效果的納米復合物。首先選取細胞穿膜肽中的八聚精氨酸（R8）作為siRNA的基本載體，采用硬脂酸和聚乙二醇對其進行修飾，合成出幾種載體材料。再將載體材料與siRNA孵育制備成納米復合物。然后，通過納米粒度和zeta電位分析儀及瓊脂糖凝膠電泳試驗考察納米復合物的理化性質(zhì)和包載能力，從而篩選出能夠縮合并遞送siRNA入胞的復合物。最后，以MCF-7、A549為模型細胞進行細

4、胞攝取試驗，通過與市售產(chǎn)品（Lipofectamine2000）作比較，考察自制復合物介導siRNA入胞的效果。
　　方法：
　　1.載體合成：首先，合成SA-R8。先制備SA活化反應液，再取SA活化液加入到R8溶液中反應30min，然后將反應液以純凈水為透析液透析24 h，透析結束后取少量透析液進行質(zhì)譜分析。接著，用合成的SA-R8與mPEG2000-Mal和mPEG5000-Mal反應合成SA-R8-PEG，同樣將反應液

5、以純凈水為透析液透析純化，然后取適量透析液質(zhì)譜檢測。
　　2.復合物制備及評價：合成的載體材料具備兩親性，在極性溶劑中能自組裝成納米粒；八聚精氨酸（R8）帶正電荷，可通過靜電相互作用縮合帶負電荷的siRNA?；谝陨显恚紫?，用DEPC水溶解載體材料使自組裝成空白納米粒，隨后加入藥物siRNA渦旋靜置，制備載siRNA的納米復合物。然后，通過納米粒度和zeta電位分析儀對復合物的粒徑、電位進行測定。接著，通過瓊脂糖凝膠電泳試驗對

6、復合物包載siRNA的能力進行考察。根據(jù)考察結果，篩選出粒徑、電位合適且能夠完全包載siRNA的復合物。最后，以MCF-7和A549兩種細胞為模型細胞，將篩選出的最佳復合物與游離siRNA和市售產(chǎn)品（Lipofectamine2000）一同給藥進行細胞攝取試驗，通過流式細胞分析儀定量檢測及評價自制復合物的細胞轉(zhuǎn)染效果。
　　結果：
　　質(zhì)譜檢測結果顯示，合成的SA-R8、SA-R8-PEG2000和SA-R8-PEG5000

7、實際分子量與理論值一致或相近；復合物(SA-R8/SA-R8-PEG200020％)/siRNA的平均粒徑在300~400nm之間，復合物(SA-R8/SA-R8-PEG500020%)/siRNA平均粒徑在500~800nm之間，隨著N/P比的增大，兩者zeta電位從負變?yōu)檎?；瓊脂糖凝膠電泳試驗顯示，兩種復合物(SA-R8/SA-R8-PEG200020%)/siRNA和(SA-R8/SA-R8-PEG500020%)/siRNA均在

8、N/P比為20:1時完全包載siRNA；細胞攝取試驗分析顯示兩種納米復合物能夠成功地將siRNA轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞；且自制載體SR/SRP2K介導siRNA轉(zhuǎn)染細胞能力與市售產(chǎn)品（Lipofectamine2000）不存在統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　結論：
　　1.本文成功合成了載體材料SA-R8-PEG2000和SA-R8-PEG5000，且方法簡便易行，重現(xiàn)性較好。
　　2.通過靜電相互作用成功制備了載siRNA

9、的納米復合物，且方法操作簡便，重現(xiàn)性較好。通過粒徑、電位的測定及凝膠電泳試驗證明復合物能夠成功包載模型藥物siRNA。
　　3.細胞攝取試驗表明，相比游離siRNA，當N/P為20:1時，兩種復合物(SA-R8/SA-R8-PEG200020%)/siRNA和(SA-R8/SA-R8-PEG500020%)/siRNA明顯提高了siRNA的細胞攝??；且自制載體SR/SRP2K（載體SA-R8/SA-R8-PEG200020%的縮寫