DEFA1和BECN1相互影響調(diào)節(jié)大自噬的生理過程.pdf

1、目的：為了觀察大自噬和抗菌肽在細(xì)胞內(nèi)的相互作用關(guān)系，兩者都在生物細(xì)胞的抗菌作用中起著關(guān)鍵性的作用。本實(shí)驗(yàn)選擇了抗菌肽的一個(gè)代表DEFA1，通過觀察它和大自噬的相關(guān)蛋白BECN1之間的相互作用說明DEFA1是如何參與和調(diào)節(jié)大自噬的過程的。
　　方法：應(yīng)用免疫共沉淀、蛋白免疫印跡和共聚焦顯微鏡等方法，同時(shí)采用可以調(diào)節(jié)大自噬過程的處理方法并在不同的時(shí)間窗來觀察BECN1和DEFA1蛋白以及大自噬的變化。將BECN1-myc和DEFA1-

2、flag質(zhì)粒分別以及合并轉(zhuǎn)染給人胚腎293細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，同時(shí)將其轉(zhuǎn)染給人宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行熒光染色以及將帶有不同熒光質(zhì)粒的BECN1和DEFA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染給人宮頸癌細(xì)胞制成樣本，采用共聚焦顯微鏡觀察其結(jié)果以印證免疫共沉淀結(jié)果；另外，將轉(zhuǎn)染了BECN1和DEFA1質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)和抑制大自噬的處理在不同時(shí)間點(diǎn)觀察兩個(gè)目的蛋白以及大自噬過程的變化。同時(shí)為了檢測(cè)兩個(gè)蛋白在其他蛋白降解途徑中的變化，用蛋白酶抑制劑處理兩種蛋白轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞并

3、檢測(cè)其變化。其中蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果量化分析后加以統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各個(gè)量之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05表示差異具有顯著性。
　　結(jié)果：
　　1. DEFA1和BECN1在細(xì)胞內(nèi)可互相結(jié)合。
　　2. BECN1和DEFA1都可與溶酶體結(jié)合，并使溶酶體向細(xì)胞核聚攏；細(xì)胞共轉(zhuǎn)染BECN1和DEFA1后溶酶體和DEFA1的結(jié)合率明顯增高。
　　3.在饑餓引發(fā)的大自噬過程中，BECN1隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)沒有顯著的形態(tài)學(xué)變化；

4、DEFA1在饑餓2小時(shí)時(shí)即圍成環(huán)狀位于近核區(qū)并維持這個(gè)形態(tài)持續(xù)至饑餓12小時(shí)；LC3在未受饑餓處理時(shí)是散在狀和點(diǎn)狀混合存在的，而在饑餓2小時(shí)時(shí)散在狀和點(diǎn)狀形態(tài)分開，饑餓4到12小時(shí)只剩點(diǎn)狀形態(tài)的LC3。在BECN1和DEFA1共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,BECN1在2小時(shí)時(shí)出現(xiàn)略微的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；BECN1和LC3共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中LC3受BECN1的保護(hù)在饑餓4個(gè)小時(shí)的情況下也沒出現(xiàn)顯著的形態(tài)變化；DEFA1和LC3共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中LC3在饑餓4小時(shí)時(shí)受到D

5、EFA1的影響其形態(tài)與DEFA1相似。而在BECN1，DEFA1和LC3共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中LC3受BECN1和DEFA1影響信號(hào)顯示非常弱，在饑餓2小時(shí)時(shí)各個(gè)蛋白均呈現(xiàn)散狀和點(diǎn)狀混合存在，而在饑餓4個(gè)小時(shí)時(shí)形態(tài)與LC3和DEFA1共轉(zhuǎn)染4個(gè)小時(shí)的形態(tài)幾乎相同，BECN1卻沒有顯著的形態(tài)變化。
　　4.通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BECN1，DEFA1和LC3（內(nèi)源）在饑餓2小時(shí)和4小時(shí)條件下的互相影響，在此過程中DEFA1增強(qiáng)了BECN1的降

6、解，而BECN1卻保護(hù)了 DEFA1不被降解。轉(zhuǎn)染了 BECN1、DEFA1和 BECN1&DEFA1質(zhì)粒的細(xì)胞中LC3-II/LC3-I比值有所增加。在饑餓誘導(dǎo)大自噬后，除了轉(zhuǎn)染 BECN1的細(xì)胞其余所有的LC3-II/LC3-I比值都增加了。
　　5.巴弗洛霉素保護(hù)DEFA1不被降解的作用比對(duì)BECN1的強(qiáng)。DEFA1能增強(qiáng)巴弗洛霉素對(duì)BECN1降解的保護(hù)作用，而BECN1能增強(qiáng)巴弗洛霉素對(duì)DEFA1降解的保護(hù)作用僅僅是在巴弗

7、洛霉素的濃度為200μM時(shí)，在100μM的巴弗洛霉素中DEFA1降解受保護(hù)的作用則不被BECN1影響。在巴弗洛霉素和饑餓共同處理的情況下，100μM巴弗洛霉素對(duì)BECN1降解的保護(hù)作用比對(duì)DEFA1的強(qiáng)，當(dāng)巴弗洛霉素的濃度為200μM時(shí)間為6小時(shí)時(shí)和100μM時(shí)相同，而12小時(shí)時(shí)卻相反。
　　6.溶酶體抑制劑（E64d/Pepstatin A)和饑餓條件共同作用于BECN1和DEFA1時(shí)，溶酶體抑制劑在12小時(shí)時(shí)對(duì)BECN1降解的