精子發(fā)生相關(guān)蛋白Stra8與Setd8的相互作用研究.pdf

1、Stra8(stimulated by retinoic acid gene8)是一種視黃酸(retinoic acid,RA)反應(yīng)基因，在成年小鼠睪丸中特異性表達(dá)，同時其蛋白在睪丸中的表達(dá)具有階段和細(xì)胞特異性。Stra8對于精子發(fā)生的過程是至關(guān)重要的。Stra8基因敲除的雄性小鼠不育，精子發(fā)生過程受到嚴(yán)重影響。本實驗室在前期工作中以Stra8蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)從小鼠精原干細(xì)胞cDNA文庫中篩選與Stra8相互作用的蛋白，結(jié)

2、果發(fā)現(xiàn)一個新的與Stra8相互作用的蛋白-Setd8蛋白。Setd8是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)唯一能夠特異性單甲基化H4K20的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，在許多生理過程中發(fā)揮著重要作用，但目前為止未見在生精細(xì)胞中的研究。本研究主要探討精子發(fā)生相關(guān)蛋白Stra8與Setd8的相互作用機(jī)制，為以后進(jìn)一步研究Stra8與Setd8在精子發(fā)生中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　第一，利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，明確Stra8與Setd8能夠相互轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　

3、(一)Setd8對Stra8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析。構(gòu)建含有Stra8啟動子的重組質(zhì)粒pGL3-Stra8Pro，與pRL-CMV共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，檢測熒光素酶活性，確定Stra8啟動子有轉(zhuǎn)錄活性。然后用空載pCMV-HA、pCMV-HA-Setd8分別與pGL3-Stra8Pro共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，通過檢測熒光素酶活性，確定Setd8蛋白能夠抑制Stra8啟動子轉(zhuǎn)錄活性。此外，我們在上述系統(tǒng)中加入0、0.0625μg、0.125μg、

4、0.25μg和0.5μg不同含量的pCMV-HA-Setd8，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同含量的Setd8蛋白對Stra8啟動子活性無顯著影響。
　?。ǘ㏒tra8對Setd8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析。構(gòu)建含有Setd8不同長度啟動子的重組質(zhì)粒pGL3-Setd8Pro，分別與pRL-CMV共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，檢測熒光素酶活性，確定Setd84種不同長度啟動子均有轉(zhuǎn)錄活性，其中在Setd8 mRNA上游-1499～+1bp的啟動子轉(zhuǎn)錄活性最強。因此

5、我們選擇pGL3-Setd8ProF2R用于后續(xù)實驗。然后用空載pCMV-Myc、pCMV-Myc-Stra8分別與pGL3-Setd8ProF2R共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，通過檢測熒光素酶活性，確定Stra8蛋白能夠增強Setd8啟動子轉(zhuǎn)錄活性。此外，我們在上述系統(tǒng)中加入0、0.0625tg、0.125μg、0.25μg和0.5μg不同含量的pCMV-Myc-Stra8。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入的蛋白量達(dá)到0.25μg時，能顯著增強Setd8啟動

6、子轉(zhuǎn)錄活性。
　　第二，Stra8與Setd8相互作用位點分析。
　　（一）根據(jù)Setd8含有的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建含有五種不同長短的Setd8截短片段的pGADT7重組質(zhì)粒。將Setd8全長、五種截短片段和Setd8NO.50(81-286aa)分別與pGBKT7-Stra8片段共轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109中，并在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SD/-LTAH/X-α-gal中培養(yǎng)。結(jié)果顯示:Setd8全長以及構(gòu)建的五個Setd8截短片段，均不能

7、與Stra8片段相互作用，而Setd8NO.50(81-286aa)與Stra8片段能夠相互作用。
　?。ǘ?gòu)建Setd8F1R1（全長）及4種不同長短的Setd8截短片段的真核表達(dá)重組質(zhì)粒。構(gòu)建完成后瞬時轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中驗證其表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這五種重組質(zhì)粒蛋白都能正確表達(dá)。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒、pCMV-HA-Setd8NO.50分別與pCMV-Myc-Stra8全長共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，在293T細(xì)胞總蛋白中用鼠抗C-My

8、c進(jìn)行免疫共沉淀，用兔抗HA進(jìn)行Western Blot分析。結(jié)果表明，只有Setd8NO.50能夠與Stra8相互作用，其余的重組質(zhì)粒都沒有相互作用。
　　第三，利用免疫共沉淀確定Setd8與Stra8相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。
　　構(gòu)建3種不同長短的Stra8截短片段的真核表達(dá)重組質(zhì)粒。構(gòu)建完成后瞬時轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中驗證其表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這三種重組質(zhì)粒只有一種能正確表達(dá)蛋白，其余兩種不表達(dá)蛋白。然后將能正確表達(dá)蛋白的質(zhì)粒與

9、pCMV-HA-Setd8全長共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，在293T細(xì)胞總蛋白中用鼠抗C-Myc進(jìn)行免疫共沉淀，用兔抗HA進(jìn)行Western Blot分析。結(jié)果表明，構(gòu)建的Stra8截短片段與Setd8全長沒有相互作用。
　　第四，Stra8過表達(dá)對生精細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。
　?。ㄒ唬├肧RB細(xì)胞增殖實驗研究Stra8穩(wěn)定過表達(dá)的精原細(xì)胞株Stra8-GC1與對照組Control-GC1在細(xì)胞增殖上是否有差異。根據(jù)細(xì)胞計數(shù)

10、使得起始細(xì)胞數(shù)相同，分別在鋪板后4h(day0)、day1、day2、day3、day4、day5時間點收集細(xì)胞，繪制生長曲線。由結(jié)果可知，每個對應(yīng)時間點OD值均無統(tǒng)計學(xué)差異。說明Stra8對體外培養(yǎng)的精原細(xì)胞增殖無明顯影響。其次，我們利用流式細(xì)胞儀對上述細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞周期的檢測，結(jié)果表明，Stra8過表達(dá)對精原細(xì)胞細(xì)胞周期的影響無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與SRB增殖實驗的結(jié)果相吻合。綜上結(jié)果說明Stra8對體外培養(yǎng)的精原細(xì)胞的分裂

11、增殖無明顯影響。
　　（二）Stra8過表達(dá)對生精細(xì)胞凋亡的影響。利用PI/AnnexinV雙標(biāo)記檢測Stra8-GC1和Control-GC1在正常培養(yǎng)狀態(tài)下凋亡的發(fā)生率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Stra8-GC1的早期凋亡率比Control-GC1的早期凋亡低，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　第五，同步化Stra8過表達(dá)細(xì)胞，檢測細(xì)胞周期不同時期Stra8和Setd8 mRNA水平。
　?。ㄒ唬┙?jīng)過實驗方法的優(yōu)化，最終用

12、無血清的DMEM培養(yǎng)Stra8-GC1細(xì)胞3天后，G0/G1期比例在60％以上;利用胸苷處理細(xì)胞20h后，S期比例能達(dá)到65％。利用諾考達(dá)唑處理8h后，將細(xì)胞阻滯在G2/M期。使用“拍打”的方法收集細(xì)胞。G2/M期比例達(dá)到90％以上，純度較高。
　?。ǘ?利用RT-PCR檢測上述同步化方法后的細(xì)胞周期不同時期Stra8和Setd8 mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Stra8-GC1細(xì)胞中，Stra8和Setd8 mRNA水平在G0/G1

13、期最低，至S期逐漸升高，Setd8 mRNA水平在G2/M期保持不變，而Stra8有一定的下降。
　　通過上述研究，我們明確了Stra8和Setd8能夠相互進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Stra8與Setd8蛋白能夠相互作用，但其相互作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Stra8對體外培養(yǎng)的生精細(xì)胞的增殖沒有明顯影響，而Stra8穩(wěn)定過表達(dá)的精原細(xì)胞早期凋亡率比對照組低。Stra8和Setd8mRNA水平在精原細(xì)胞不同的細(xì)胞周期時相中表達(dá)具有一定的規(guī)律性。這