用慢病毒rna干擾系統(tǒng)研究精子發(fā)生相關(guān)基因znf230的功能

1、摘要：項目研究內(nèi)容和意義簡介項目研究內(nèi)容和意義簡介（限400字）：RNA干擾（RNAinterferenceRNAi）是由雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性的mRNA降解所致的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程。RNAi技術(shù)可方便快捷地研究基因的功能，并用于功能基因的篩選。本課題擬采用RNAi及胚胎干細(xì)胞體外定向分化技術(shù)，將我室新克隆的精子發(fā)生相關(guān)基因znf230的siRNA通過慢病毒（Lentivirus）系統(tǒng)引入小鼠胚胎干細(xì)胞，體外模擬精子發(fā)生過程，而在細(xì)

2、胞水平上研究znf230基因表達(dá)受抑后對生精的影響，同時結(jié)合基因表達(dá)譜芯片及蛋白組二維電泳質(zhì)譜技術(shù)實現(xiàn)基因功能性及蛋白質(zhì)表達(dá)篩查，以期全面研究該基因的功能。上述技術(shù)平臺的建立將提供一個精子發(fā)生相關(guān)基因功能研究的模型，亦為RNAi技術(shù)的應(yīng)用研究拓展了新的思路。這一設(shè)想尚未見文獻(xiàn)報道，如能證明其合理有效，將成為難于鑒定表型且異常表達(dá)的基因功能研究的通用模型，并在后續(xù)蛋白組學(xué)及基因相關(guān)藥物的研發(fā)中發(fā)揮重要作用。報告正文報告正文因此，建立高效、

3、穩(wěn)定長期表達(dá)的RNAi傳遞系統(tǒng)正是該領(lǐng)域目前研究的關(guān)鍵。雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒的運(yùn)用能有效地降低靶基因的表達(dá)[11]，但MMLV類病毒自身特點及對細(xì)胞類型的選擇性使其應(yīng)用受到一定的限制。當(dāng)前，新型第三代慢病毒(Lentivirus)系統(tǒng)正以其高效、穩(wěn)定的特性在RNAi研究中倍受關(guān)注。Lentivirus來源于HIV1病毒，其宿主細(xì)胞范圍廣泛，包括分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞、原始細(xì)胞等，且轉(zhuǎn)基因在生殖系統(tǒng)中可穩(wěn)定傳遞[1213]。Pfeifer[14]

4、等的研究結(jié)果表明，Lentivirus介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因均可在鼠胚胎干細(xì)胞(EmbryonicStemES)體內(nèi)、外分化過程中表達(dá)，將Lentivirus感染的ES細(xì)胞注入胚泡期或桑椹期胚胎，發(fā)育的新生鼠及其子代的多種組織中均可檢測到轉(zhuǎn)基因。Tiscnia[15]等將沉默GFP的Lentivirus感染GFP陽性轉(zhuǎn)基因鼠卵細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)新生鼠體內(nèi)GFP熒光蛋白的表達(dá)明顯降低。Rubison[16]等運(yùn)用CD8CD25siRNA的Lentiviru

5、s載體轉(zhuǎn)染鼠ES細(xì)胞，生成了“knockdown”轉(zhuǎn)基因鼠，其效應(yīng)維持長達(dá)30天之久并可傳遞下一代，充分顯示了該方法的優(yōu)越性。精子發(fā)生是一個復(fù)雜的多階段的細(xì)胞分化過程，涉及生精細(xì)胞的生長、分裂、分化和信號傳遞等，要求一系列基因表達(dá)的精確調(diào)控[1718]。這些基因的異常將導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，表現(xiàn)為寡精癥或無精癥。近年來我室分離克隆了一系列可能與精子發(fā)生相關(guān)的基因[1922]，目前已初步闡明了這些基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)，如ZNF230在無精癥患者睪

6、丸組織中無表達(dá)，znf230在小鼠睪丸內(nèi)特異表達(dá)且可能在精細(xì)胞(spermatid)形成階段起重要作用[22]。由于生精過程極其復(fù)雜，這些基因的調(diào)控及其生物學(xué)功能尚未明了。為探索此類問題，首先需建立供研究的模型系統(tǒng)。2003年末，ToshiakiNoce研究小組[23]成功地將小鼠ES細(xì)胞在體外定向分化成精子。研究中，懸浮培養(yǎng)的ES細(xì)胞在BMP4刺激及擬胚體立體空間構(gòu)型的影響下向原始生殖細(xì)胞(primdialgermcellsPGCs)

7、分化，具PGCs性質(zhì)的ES細(xì)胞aggregation移植至裸鼠的睪丸囊中即可發(fā)育成成熟的精子。此外，Daley及Geijsen等研究小組[24]也報道了ES細(xì)胞體外分化成精子的新進(jìn)展?；谝陨蟁NAi研究所取得的成果，結(jié)合鼠ES細(xì)胞體外定向分化新技術(shù)，我們設(shè)想如能將Lentivirus系統(tǒng)引入小鼠ES細(xì)胞使之長期穩(wěn)定表達(dá)、發(fā)揮RNAi效應(yīng)，則可模擬興趣基因在特定疾病中的異常表達(dá)情況，進(jìn)而確定其功能。因此，可將ES細(xì)胞在體外定向分化成精子