硼替佐米對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡及其對(duì)XIAP表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑，可影響基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種細(xì)胞活動(dòng)[1]。蛋白酶體活性的異常改變，可引起多種蛋白質(zhì)降解異常，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，使腫瘤細(xì)胞持續(xù)生長，是腫瘤發(fā)生的標(biāo)志之一。蛋白酶體抑制劑特異性地抑制蛋白酶體活性，阻止腫瘤生長、粘附及血管生成[2]，可以作為抗腫瘤治療的有效靶點(diǎn)。硼替佐米(Bo

2、rtezomib，商品名萬坷，Velcade)是高選擇性的，可逆性的蛋白酶體抑制劑，通過抑制多種蛋白質(zhì)的降解，可以穩(wěn)定p21，p27和p53蛋白，轉(zhuǎn)錄因子(如c-myc、c-fos、c-jun)，IκB，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白和一些Bcl-2家族成員(如Bak and Bax)[3，4]。在生理情況下NF-κB在胞質(zhì)中與抑制蛋白IκB結(jié)合，硼替佐米通過抑制IκB的降解，下調(diào)NF-κB的活性，不但可以增加腫瘤細(xì)胞的凋亡[5，6，7]，還可以增加

3、腫瘤細(xì)胞對(duì)化療、放療[8]、免疫治療的敏感性[9]。X連鎖凋亡抑制蛋白(X chromosome linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是內(nèi)源性凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis，IAPs)中效力最強(qiáng)的蛋白，它主要通過BIR3結(jié)構(gòu)域抑制caspase-9，BIR2結(jié)構(gòu)域抑制caspase-3和-7[10]，達(dá)到抑制凋亡的作用。XIAP的表達(dá)受多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影

4、響，NF-κB，PI3K和MAPK等均可間接調(diào)節(jié)XIAP的轉(zhuǎn)錄。有資料顯示XIAP基因在多個(gè)白血病細(xì)胞株及急性白血病原代細(xì)胞中高表達(dá)[11]，這提示XIAP可能與白血病的發(fā)生、病程演變及預(yù)后等密切相關(guān)[12]。本研究觀察硼替佐米對(duì)K562細(xì)胞增殖、凋亡及XIAP基因和蛋白表達(dá)的影響，研究硼替佐米對(duì)白血病細(xì)胞的作用及其與XIAP之間的關(guān)系，為其做為新的抗白血病藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.水溶性四唑鹽光吸收(

5、WST-1)法檢測細(xì)胞增殖：終濃度為5nmol/L，10nmol/L，30nmol/L，50nmol/L，100nmol/L硼替佐米分別作用于K562細(xì)胞12h、24h、36h、48h，WST-1法檢測細(xì)胞的增殖情況，計(jì)算增殖抑制率，并找出硼替佐米作用于K562細(xì)胞的最適時(shí)間及作用濃度。
　　 2.瑞氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)：終濃度為30nmol/L硼替佐米處理K562細(xì)胞24h后，瑞氏染色觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)變化。
　　

6、 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：終濃度為5nmol/L，10nmol/L，30nmol/L，50nmol/L，100nmol/L硼替佐米分別作用于K562細(xì)胞24h，流式細(xì)胞儀AnnexinV FITC/PI雙標(biāo)檢測細(xì)胞凋亡率。
　　 4.原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：終濃度為30nmol/L硼替佐米處理K562細(xì)胞24h后，TUNEL技術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況。
　　 5.RT-PCR法檢測XIAP mR

7、NA的表達(dá)：終濃度為5nmol/L，10nmol/L，30nmol/L，50nmol/L，100nmol/L硼替佐米分別作用于K562細(xì)胞24h，RT-PCR法檢測硼替佐米對(duì)K562細(xì)胞XIAP mRNA表達(dá)的影響。
　　 6.免疫組化法檢測XIAP蛋白的表達(dá)：終濃度為30nmol/L硼替佐米作用于K562細(xì)胞24h，免疫組化法檢測硼替佐米對(duì)K562細(xì)胞XIAP蛋白表達(dá)的影響。
　　 7.統(tǒng)計(jì)分析：所得結(jié)果應(yīng)用SPSS1

8、3.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，對(duì)計(jì)量資料，同一時(shí)間點(diǎn)各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間比較用兩樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1.WST-1結(jié)果顯示：終濃度為5nmol/L、10nmol/L、30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L的硼替佐米分別作于K562細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率分別為(13.64±0.15

9、)％、(28.7±0.49)％、(55.4±1.11)％、(68.1±1.12)％、(81.4±0.13)％，分別與空白對(duì)照組比較存在顯著差異(P<0.01)；硼替佐米組間兩兩比較，具有顯著性差異(P<0.05)，其24小時(shí)IC50為24.6 nmol/L。30nmol/L硼替佐米分別作用于K562細(xì)胞12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為(29.1±0.92)％、(55.4±1.11)％、(57.84±0.84)％、

10、(59.8±1.18)％，分別與空白對(duì)照組相比，有顯著性差異(P<0.05)；組間兩兩比較，硼替佐米12h與24h對(duì)K562細(xì)胞的抑制率有顯著性差異(P>0.05)，但24h與36h、48h的抑制率無顯著性差異(P>0.05)。
　　 2.細(xì)胞形態(tài)、TUNEL及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：終濃度為30nmol/L硼替佐米處理K562細(xì)胞24h，瑞氏染色，光學(xué)顯微鏡下示硼替佐米組細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為染色質(zhì)濃縮，核固縮、核邊集、核

11、碎裂，胞質(zhì)中見大量空泡及凋亡小體形成；正常對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常。TUNEL法計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)為147，陽性率為49.0％，與空白對(duì)照組(陽性細(xì)胞數(shù)7，陽性率2.3％)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。濃度為5nmol/L、10nmol/L、30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L的硼替佐米分別作于K562細(xì)胞24小時(shí)，AnnexinVFITC/PI雙標(biāo)結(jié)果顯示凋亡率分別為：(15.36±0.7)％，(32.2

12、1±1.2)％，(53.87±1.3)％，(77.854±1.0)％，(81.25±2.8)％。均高于對(duì)照組(0.32±0.6％)，P<0.01。進(jìn)一步行組間兩兩比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 3.RT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示：濃度為5nmol/L、10nmol/L、30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L的硼替佐米分別作于K562細(xì)胞24小時(shí)后，RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，XIAP mRNA灰度比

13、值分別為0.89±0.029，0.79±0.022，0.59±0.031，0.34±0.037，0.24±0.042，與空白對(duì)照組(0.96±0.020)相比有顯著差異，p<0.01；不同濃度硼替佐米之間XIAPmRNA灰度比值相比有顯著差異，p<0.05。終濃度為30nmol/L硼替佐米處理細(xì)胞24h后，經(jīng)免疫組化法染色法檢測結(jié)果顯示：K562細(xì)胞中XIAP蛋白陽性表達(dá)率在硼替佐米組為(13.33±2.71)％，與空白組(55.90±

14、1.65)％相比顯著降低(P<0.01)。硼替佐米組XIAP蛋白表達(dá)陽性平均積分為42.00±8.54，較空白組248.33±20.74有顯著性差異(P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.硼替佐米能有效抑制K562細(xì)胞的增殖，其抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴性。
　　 2.硼替佐米能明顯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，隨時(shí)間增加凋亡率增加。
　　 3.硼替佐米能明顯下調(diào)K562細(xì)胞XIAP mRNA及XIAP蛋白的