Livin siRNA重組腺病毒的構(gòu)建及其對K562細胞增殖、凋亡及耐藥的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建含特異性針對Livin siRNA的重組腺病毒，抑制Livin基因的表達，觀察重組腺病毒對K562細胞的增殖、凋亡及耐藥的影響，為進一步探索白血病的基因治療提供實驗依據(jù)。 方法：1.構(gòu)建含特異性Livin siRNA的重組腺病毒。酶切穿梭質(zhì)粒pSES-HUS，用DNA連接試劑盒將載體和目的siRNA定向克隆連接，篩選和鑒定重組質(zhì)粒pSES-HUS-Livin siRNA?；驕y序，把正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入腺病毒同源骨架質(zhì)粒

2、BJ-Adeasy中，產(chǎn)生腺病毒質(zhì)粒Adeasy-Livin siRNA，酶切鑒定。同源重組成功的質(zhì)粒，用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細胞，乒乓感染收獲高滴度的Ad5-Livin siRNA。2.檢測轉(zhuǎn)染Ad5-Livin siRNA對K562細胞Livin表達的影響。實驗分為四組：未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染重組腺病毒空載體組，轉(zhuǎn)染Ad5-Livin siRNA-1組和Ad5-Livin siRNA-2組。應(yīng)用流式細胞術(shù)，Real-time PC

3、R和Western Blot方法檢測Livin基因的干擾效果。3.檢測Ad5-Lvin siRNA對K562細胞增殖及凋亡的影響。采用MTT和AnnexinV-FITC/PI方法檢測轉(zhuǎn)染病毒后細胞增殖和凋亡的變化。4.檢測轉(zhuǎn)染Ad5-Lvin siRNA對K562細胞耐藥性的影響。選用不同濃度的阿霉素、依托泊苷、長春新堿和順鉑，通過MTT法抗癌藥物敏感試驗檢測干擾Livin基因后細胞耐藥性的變化。 結(jié)果：1.成功構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)

4、粒Adeasy-Livin siRNA，并轉(zhuǎn)染包裝細胞，得到高滴度的重組腺病毒，病毒滴度達到1.1×1011pfu/ml。2.K562細胞轉(zhuǎn)染重組腺病毒后，MOI=100時，轉(zhuǎn)染率及存活率均較好，轉(zhuǎn)染率為15.91％。3.K562細胞中Livin mRNA和蛋白高表達，轉(zhuǎn)染siRNA組的Livin表達下調(diào)，而轉(zhuǎn)染空載體組無明顯變化（p<0.01）。4.重組腺病毒沉默Livin基因后，與對照組相比，明顯抑制K562細胞的增殖，誘導(dǎo)其自發(fā)凋

5、亡，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。5.轉(zhuǎn)染Ad5-Livin siRNA增加K562細胞對化療藥物的敏感性（如ADM、VP16、VCR），各藥的IC50均明顯下降，與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染空載體組相比，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。但重組腺病毒對DDP沒有影響（p>0.05）。 結(jié)論：1.應(yīng)用分子生物學(xué)方法構(gòu)建并收獲高滴度的含靶向Livin siRNA的重組腺病毒。2.通過腺病毒載體可將Livin siRNA成功轉(zhuǎn)染K562細胞