硼替佐米對伊馬替尼耐藥細(xì)胞株K562-G01增殖和藥物敏感作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia，簡稱CML)是一種常見的血液系統(tǒng)增殖性惡性腫瘤，約95％的患者可檢測出Ph染色體。酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼(imatinib，STI571商品名格列衛(wèi))自問世以來，在治療CML方面取得了好的療效，目前已成為CML的一線治療。但隨著伊馬替尼的廣泛應(yīng)用，臨床上逐漸出現(xiàn)不敏感、甚至耐藥等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響有效治療。因此，尋找新的治療方案，提高伊馬替尼對這部分患者

2、的療效已成為國內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)。蛋白酶體抑制劑硼替佐米(bortezomib，velacde商品名萬珂)通過阻斷泛素-蛋白酶體通路可誘導(dǎo)人體多種腫瘤細(xì)胞凋亡，已用于臨床治療多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤及漿細(xì)胞白血病等多種疾病。
　　 目的：探討硼替佐米對伊馬替尼耐藥細(xì)胞株(K562/G01)增殖和藥物敏感性的影響，進(jìn)而對其可能機(jī)制進(jìn)行研究，為難治性耐藥白血病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：⑴實(shí)驗(yàn)測定硼替佐米工作濃度及

3、藥敏性：實(shí)驗(yàn)首先測定硼替佐米的細(xì)胞毒性，確定硼替佐米的工作濃度為進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)確定濃度；測定硼替佐米對耐藥株藥物敏感性的影響；為進(jìn)一步研究其可能機(jī)制提供依據(jù)。⑵具體實(shí)驗(yàn)觀察：四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測硼替佐米的細(xì)胞毒性；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測硼替佐米對耐藥株的增敏倍數(shù)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測COX-2和MDR-1 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：①M(fèi)TT試

4、驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的硼替佐米作用不同時(shí)間后均具有一定的抑制作用，在同一時(shí)間點(diǎn)硼替佐米對細(xì)胞的生長抑制作用呈劑量依賴性(P＜0.05)，同一濃度硼替佐米在48h時(shí)抑制效果達(dá)高峰。硼替佐米作用于K562/G01細(xì)胞48h時(shí)IC50值為23.10(±2.71)nmol/L，本實(shí)驗(yàn)中選取10和20nmol/L兩個(gè)工作濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。②伊馬替尼處理K562/G01和K562細(xì)胞72h后，用MTT法觀察到K562/G01細(xì)胞對伊馬替尼不敏感，

5、耐藥倍數(shù)為37.20倍。10和20nmol/L硼替佐米預(yù)處理K562/G01細(xì)胞后，伊馬替尼對K562/G01細(xì)胞的IC50值較單用伊馬替尼組明顯降低(P＜0.05)，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.83、2.72倍。③流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，硼替佐米作用于K562/G01細(xì)胞后細(xì)胞周期出現(xiàn)G2/M期阻滯，于20nmol/L BOR作用24h后達(dá)到高峰值(42.71±0.64)％；同時(shí)細(xì)胞凋亡率也逐漸升高，其效應(yīng)呈濃度-時(shí)間依賴性，20nmol/L BO

6、R作用48h后凋亡率達(dá)(46.51±0.727)％。比較BOR于不同時(shí)間點(diǎn)對K562/G01細(xì)胞G2/M期和凋亡率的影響，發(fā)現(xiàn)G2/M期阻滯早于細(xì)胞凋亡的發(fā)生。④Real time-PCR檢測結(jié)果顯示，K562/G01細(xì)胞株高表達(dá)COX-2和MDR-1 mRNA，其表達(dá)量分別是K562細(xì)胞株的2.27±0.16倍和3.20±0.24倍，提示伊馬替尼耐藥與COX-2和MDR-1有關(guān)。硼替佐米作用于K562/G01細(xì)胞后，可能是通過下調(diào)CO