硼替佐米聯(lián)合表阿霉素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、背景:乳腺癌是嚴(yán)重影響廣大婦女身體健康的惡性腫瘤，主要是由乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性細(xì)胞增殖。近年來(lái)，蛋白酶體通路在惡性腫瘤治療中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。泛素-蛋白酶體途徑能夠選擇性地降解細(xì)胞內(nèi)某些具有生物活性的蛋白質(zhì)，特別是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、分化和增殖等生理過(guò)程;選擇性降解癌基因及抑癌基因的產(chǎn)物、激活物或抑制物、凋亡調(diào)控蛋白等，達(dá)到調(diào)控細(xì)胞突變和腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移的目的。硼替佐米(Bortezomib，Velcade

2、)作為第一個(gè)蛋白酶體抑制劑藥物，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，現(xiàn)已用于治療耐藥的多發(fā)性骨髓瘤患者;并且越來(lái)越多的臨床試驗(yàn)證明硼替佐米對(duì)其他多種惡性腫瘤具有治療作用。
　　 目的:研究蛋白酶體抑制劑硼替佐米單藥及與表阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探討其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制作用及特點(diǎn)，觀察硼替佐米單藥及與表阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的作用，以及乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，探討硼替佐米

3、對(duì)乳腺癌細(xì)胞抑制作用的可能機(jī)制。
　　 方法:本實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。采用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7乳腺癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為0.05、0.25、0.50、1.00、5.00μg/mL的表阿霉素（設(shè)為A1、B1、C1、D1、E1組），終濃度為0.01、0.10、1.00、5.00、10.00μg/mL的硼替佐米（設(shè)為A2、B2、C2、D2、E2組），以及硼替佐米與表阿霉素各濃度的組合（表阿

4、霉素0.05μg/mL+硼替佐米0.01、0.10、1.00、5.00、10.00μg/mL，設(shè)為A1A2、A1B2、A1C2、A1D2、A1E2組;其余各組同前，分別為:B1A2、B1B2、B1C2、B1D2、B1E2組;C1A2、C1B2、C1C2、 C1D2、C1E2組;D1A2、D1B2、D1C2、D1D2、D1E2組;E1A2、E1B2、E1C2、E1D2、E1E2組，共25組），分別培養(yǎng)24h，48h及72h， MTT法測(cè)細(xì)

5、胞生長(zhǎng)抑制率。選擇藥物濃度為0.10μg/mL硼替佐米+0.50μg/mL表阿霉素、0.10μg/mL硼替佐米+0.25μg/mL表阿霉素聯(lián)合以及相同濃度的表阿霉素、硼替佐米單藥培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞不同時(shí)間(24h、48h和72h)，碘化丙啶(PI)染色法應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期變化;AnnexinV-PI雙染方法應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。選擇藥物濃度為0.10μg/mL硼替佐米+0.50μg/mL表阿霉素、以及單藥培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞4

6、8h，RT-PCR和熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)EGFR、TGF-β1mRNA表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:硼替佐米單藥濃度≥0.10μg/mL（B2、C2、D2、E2組），對(duì)MCF-7具有明顯的抑制作用，差異具有顯著性(P＜0.05)，其抑制效果在各作用時(shí)間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。因而，硼替佐米可一定程度地抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)，其抑制作用未呈現(xiàn)出明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。表阿霉素單藥濃度＞0.25μg/mL時(shí)(B1

7、、C1、D1、E1組)，對(duì)MCF-7細(xì)胞具有較明顯的抑制作用，差異具有顯著性(P＜0.05)，并且其抑制效果隨著藥物濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，差異具有顯著性(P＜0.05)，從而呈現(xiàn)出明顯的濃度-時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。另外，與硼替佐米和表阿霉素單藥組相比，硼替佐米與表阿霉素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可以明顯提高對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用，且在較低劑量和較短時(shí)間產(chǎn)生明顯的抑制效果(P＜0.05)。細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:硼替佐米可使細(xì)胞大量停滯在G

8、2-M期;表阿霉素可使細(xì)胞大量停滯在S期;此外，B2、B1、C1、B1B2、C1B2各組24h細(xì)胞凋亡率分別為9.28％、10.50％、14.10％、12.50％及17.80％，均與對(duì)照組(1.74％)有顯著差異(P＜0.01);b2、b1、c1、b1b2、c1b2各組48h細(xì)胞凋亡率分別為11.40％、23.70％、30.60％、25.20％及40.70％，與對(duì)照組(4.13％)有顯著差異(P＜0.01);并且聯(lián)合用藥組與同等濃度單藥

9、組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示硼替佐米單藥以及聯(lián)合表阿霉素作用于MCF-7細(xì)胞后EGFRmRNA表達(dá)減弱，但差異不具有顯著性(P＞0.05)，表阿霉素單藥作用后EGFRmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化;而硼替佐米、表阿霉素單藥及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)TGF-β1mRNA表達(dá)的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:硼替佐米對(duì)MCF-7細(xì)胞具有一定的抑制作用，當(dāng)其與表阿霉素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可明顯提高抑制效果，表明硼