吳茱萸堿對阿爾茨海默病模型大鼠HMGB1-TLR4-NF-κB信號通路的研究.pdf

1、目的:阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種漸進性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以漸進性記憶認(rèn)知障礙、情感性格及行為改變等為主要的臨床表現(xiàn)，其病因及發(fā)病機制不詳，已成為第四大死亡原因，其發(fā)病率及死亡率逐年增高，ADI(Alzheimer's Disease International，ADI)預(yù)測2040年我國癡呆患病率將以336％比例增長，中國的癡呆病人數(shù)將等于世界發(fā)達國家癡呆數(shù)的總和（超過2000萬）。由此，AD的

2、預(yù)防和治療已經(jīng)成為世界各國研究的熱點課題。
　　目前有幾個不同的學(xué)說試圖闡明其病因:膽堿能性假說(Cholinergichypothesis)[8]，淀粉樣蛋白質(zhì)假說(Amyloid hypothesis)[9]及微管相關(guān)蛋白質(zhì)假說(Tau hypothesis)[10]等。隨著研究的深入，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，Aβ沉積誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致AD發(fā)病的主要機制。如何減輕炎癥損傷成為治療AD的一條重要途徑。
　　HMGB1最初被認(rèn)為是一

3、種高度保守的核DNA結(jié)合蛋白，參與基因表達過程中DNA復(fù)制，修復(fù)及轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。但是，一旦細胞發(fā)生損傷或凋亡，本在胞核中的HMGB1轉(zhuǎn)移到胞漿或/和細胞外。近年來，HMGB1普遍被認(rèn)為是一種在細胞外參與細胞活化及促炎因子的釋放過程中的重要細胞因子。HMGB1自身可能通過RAGE(advanced glycationend products)受體和toll樣受體如TLR2及TLR4的活化完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。這些受體的活化導(dǎo)致NF-κB（nuc

4、lear factor-κB）的活化，活化的NF-κB誘導(dǎo)造血細胞及內(nèi)皮細胞中白細胞粘附因子的上調(diào)。由此，HMGB1促進了炎癥的發(fā)生，發(fā)展。
　　吳茱萸堿(Evodiamine)來源于蕓香科植物吳茱萸的干燥近成熟果實，具有抑制腫瘤止痛降低血壓抗炎等作用。對于的治療，研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿能夠改善阿爾茨海默病的認(rèn)知功能，是一種具有抗炎生物活性的生物堿是核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的抑制劑，從而抑制COX-2的mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而抑制炎癥

5、反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展及惡化。吳茱萸堿能否通過下調(diào)HMGB1，TLR4及NF-κB的表達從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用有待進一步的研究。本實驗通過向SD大鼠雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ1-42建立阿爾茨海默病模型，觀察大鼠行為學(xué)改變以及HMGB1，TLR4及NF-κB蛋白在大鼠海馬組織中的表達情況，探討AD的發(fā)病機制及吳茱萸堿的腦保護作用及可能的機制。
　　方法:成年健康清潔級雄性SD大鼠32只，體重250±50g，按照隨機數(shù)字表法，分為假手術(shù)組(Sham

6、組)、假手術(shù)+吳茱萸堿組、AD模型組、AD+吳茱萸堿組，每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后藥物干預(yù)組采用灌胃的方式按100mg/kg給予吳茱萸堿，喂養(yǎng)3周，每日一次，而AD模型組和Sham組給予等體積的生理鹽水。三周后通運用腦立體定位儀將10μg凝聚態(tài)Aβ1-42注入雙側(cè)大鼠海馬區(qū)，從而建立AD動物模型。造模后持續(xù)給予藥物及生理鹽水干預(yù)。造模1周后通過歷時5天的Morris水迷宮實驗，評估大鼠學(xué)習(xí)記憶力的改變水平，處死動物后運用HE染色法觀察實

7、驗大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞的形態(tài)學(xué)變化，運用免疫組織化學(xué)法觀察大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞的活化水平及HMGB1，TLR4及NF-κB蛋白的表達水平，免疫印記(Western Blot)法測定HMGB1，TLR4及NF-κB蛋白的表達水平。
　　結(jié)果:
　　1 Morris水迷宮實驗:各組大鼠逃避潛伏期不同(F=38.432，P＜0.05)，穿越平臺次數(shù)不同(F=4.388，P＜0.05)。AD組大鼠與Sham組相比，逃避潛伏期明顯

8、延長、穿越平臺次數(shù)明顯減少（P值均＜0.05）。AD+吳茱萸堿組與AD組相比逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺次數(shù)明顯增加（P＜0.05）。
　　2 HE染色:Sham組海馬CA1區(qū)錐體細胞排列整齊，分布均勻，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，數(shù)量多;AD組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞排列稀疏，結(jié)構(gòu)紊亂，數(shù)量明顯減少;AD+吳茱萸堿組與AD組相比，實驗大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)和結(jié)構(gòu)均有不同程度的恢復(fù)一神經(jīng)元數(shù)量增多，排列較整齊，結(jié)構(gòu)較致密，分布較均勻。<

9、br>　　3吳茱萸堿對HMGB1，TLR4及NF-κB表達水平的影響:在AD組，HMGB1，TLR4及NF-κB的蛋白表達水平及陽性細胞數(shù)目較Sham組明顯增多(P＜0.05);吳茱萸堿干預(yù)后，HMGB1，TLR4及NF-κB的蛋白表達水平及陽性細胞數(shù)目明顯下降，與AD組相比結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1通過向大鼠雙側(cè)海馬區(qū)注射凝聚態(tài)Aβ1-42，成功建立了大鼠AD模型。
　　2 AD模型組大鼠