谷氨酸誘導(dǎo)的ATP釋放對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：
　　觀察在不同濃度谷氨酸的作用條件下神經(jīng)元細(xì)胞釋放ATP的情況;進(jìn)一步觀察與ATP釋放相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞狀態(tài)的改變;為減輕該ATP釋放引起的細(xì)胞損傷尋找有效方法。
　　方法：
　　1、原代培養(yǎng)胎齡16-18天的CD-1小鼠大腦皮層神經(jīng)元，細(xì)胞分化成熟后隨機(jī)分為A對(duì)照組;B谷氨酸處理組，谷氨酸處理組再分為不同濃度的亞組，分別為0.01 mM、0.1 mM、1mM、5 mM、10 mM，加入谷氨酸后0 min、3 m

2、in、5 min、15 min、30 min、60 min收集細(xì)胞外液，應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞外液中的ATP濃度。對(duì)照組加等量的細(xì)胞培養(yǎng)液。篩選有效的谷氨酸濃度和作用時(shí)間。
　　2、將小鼠大腦皮層神經(jīng)元隨機(jī)分為A對(duì)照組;B谷氨酸處理組(谷氨酸終濃度為0.1 mM，作用時(shí)間為30 min);C腺苷受體阻滯劑（咖啡因）組;DATPase組;E谷氨酸+咖啡因組;F谷氨酸+ ATPase組;G谷氨酸+咖啡因+ATPase組，在谷氨酸作用

3、30 min后的2h、6h、12h、24 h收集細(xì)胞外液，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞外液中LDH的釋放，進(jìn)而得到不同處理組LDH的釋放比，借此觀察細(xì)胞膜的完整性。
　　3、用蓋玻片培養(yǎng)小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞，成熟后分組同上，采用AnnexinⅤ-FITC/PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙染，在熒光顯微鏡下檢測(cè)不同處理組細(xì)胞凋亡與壞死情況。
　　結(jié)果：
　　1、細(xì)胞外液ATP濃度檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，不同濃度谷氨酸處理組的細(xì)胞外液中ATP

4、濃度均顯著增加（P＜0.01），尤其以0.1 mM谷氨酸處理組增加最為顯著;與對(duì)照組相比，谷氨酸處理3 min、5 min、15 min細(xì)胞外液ATP的釋放均有顯著增加，尤其以3 min增加最為顯著，隨著谷氨酸作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞外液中ATP的濃度逐漸降低。確定谷氨酸的有效作用代表性濃度為0.1 mM，代表性時(shí)間為3 min。
　　2、神經(jīng)元LDH釋放比檢測(cè)的結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，咖啡因組和ATPase組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與對(duì)照組

5、相比，谷氨酸處理組(谷氨酸終濃度為0.1 mM，作用時(shí)間為30 min)、谷氨酸+咖啡因組、谷氨酸+ATPase組、谷氨酸+咖啡因+ ATPase組LDH釋放比均有顯著增加(P＜0.01）;與谷氨酸處理組相比，谷氨酸+咖啡因組、谷氨酸+ ATPase組、谷氨酸+咖啡因+ATPase組LDH釋放比均有顯著降低(P＜0.01或P＜0.05)，且在2h和12h時(shí)間點(diǎn)與谷氨酸+咖啡因組相比，谷氨酸+咖啡因+ ATPase組LDH釋放比顯著降低(

6、P＜0.01或P＜0.05)，在2h、6h、12h和24 h時(shí)間點(diǎn)與谷氨酸+ATPase組相比，谷氨酸+咖啡因+ATPase組LDH釋放比顯著降低(P＜0.01或P＜0.05)。與2h相比，谷氨酸處理組和谷氨酸+ ATPase組LDH釋放比在6h顯著增加，而各組LDH釋放比在12h和24 h均顯著增加(P＜0.01)，尤以24 h增加最多。
　　3、細(xì)胞染色形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果:與對(duì)照組相比，谷氨酸處理組神經(jīng)細(xì)胞凋亡與壞死明顯增多;與谷

7、氨酸處理組相比，谷氨酸+咖啡因組、谷氨酸+ ATPase組、谷氨酸+咖啡因+ ATPase組細(xì)胞凋亡與壞死明顯減少。
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件，采用描述性分析、T檢驗(yàn)、單因素方差分析(ANOVA)等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α值為0.05，采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　神經(jīng)元細(xì)胞在谷氨酸的作用下有明顯的ATP釋放。ATP的釋放可以對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生損傷作用，通過(guò)減少AT