絞股藍(lán)皂苷抗谷氨酸誘導(dǎo)的氧化性神經(jīng)毒性的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，除能夠通過激活其離子型受體產(chǎn)生興奮性毒性外，還可通過抑制細(xì)胞膜上谷氨酸/胱氨酸逆轉(zhuǎn)運(yùn)子的作用導(dǎo)致氧化性神經(jīng)毒性。缺血、腦卒中等急性神經(jīng)損傷及早老性癡呆(Alzheimer'sdisease)、帕金森氏癥(Parkinson's disease)等慢性神經(jīng)變性疾病都與谷氨酸的氧化性神經(jīng)毒性密切相關(guān)。絞股藍(lán)[Gynostemma Pentaphyllum(Thunb)Makino]系葫蘆科

2、絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物，其主要有效成分為絞股藍(lán)皂苷(Gypenosides，GP)。目前己從其中分離鑒定出80余種皂苷，其中6種皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)與人參皂苷結(jié)構(gòu)相同。GP具有抗癌、抗衰老、降血脂、免疫調(diào)節(jié)及鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等多種藥理學(xué)作用。其中單體SH-6(原2α-羥基人參二醇皂苷)為人參二醇皂苷類，成分比較明確，其化學(xué)結(jié)構(gòu)也已得到確認(rèn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示能夠增強(qiáng)小鼠的學(xué)習(xí)記憶獲得過程。關(guān)于GP對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用已有初步研究，但從信號(hào)通路角度研

3、究其抗神經(jīng)氧化性損傷的作用機(jī)制仍鮮見報(bào)道。研究目的： 在課題組以往工作的基礎(chǔ)上，通過對(duì)GP抗谷氨酸誘導(dǎo)的氧化性神經(jīng)損傷信號(hào)通路的深入研究，進(jìn)一步從細(xì)胞和分子水平對(duì)GP的保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行探討，為分析谷氨酸在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用機(jī)制提供一定的理論依據(jù)，為神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的思路，并為抗氧化性神經(jīng)損傷藥物的研發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法：以Wistar孕大鼠(13.5～14d)胚胎原代培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元為實(shí)驗(yàn)材料，用含1

4、0％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5％CO<,2>、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行藥物分組實(shí)驗(yàn)。 1．細(xì)胞形態(tài)及MAP2免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察：適時(shí)將培養(yǎng)細(xì)胞置于倒置相差顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察；用MAP2熒光抗體標(biāo)記神經(jīng)元，DAPI復(fù)染的方法在熒光顯微鏡下觀察，顯微攝像系統(tǒng)采集圖像； 2．MTT法細(xì)胞活力檢測：MTT法進(jìn)行GP抗谷氨酸氧化性神經(jīng)毒性的作用時(shí)間分析和MEKl(MAPKK)特異性阻

5、滯劑PD98059對(duì)GP保護(hù)作用的影響分析及絞股藍(lán)單體皂苷SH-6抗谷氨酸氧化性神經(jīng)損傷的作用濃度和作用時(shí)間分析； 3．生化指標(biāo)檢測：生化檢測法測定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transfemse GSTs)的活力水平： 4．超微結(jié)構(gòu)觀察：用透射電子顯微鏡對(duì)正常對(duì)照組、谷氨酸損傷組及GP保護(hù)組細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察； 5．流式細(xì)胞儀檢測：用流式細(xì)胞儀定量檢測正常對(duì)照組、谷氨酸損傷組和GP

6、保護(hù)組細(xì)胞內(nèi)ERKl/2的磷酸化水平； 6．實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測：實(shí)時(shí)定量RT-PCR法分析正常對(duì)照組、谷氨酸損傷組、GP保護(hù)組及GP+PD98059+谷氨酸組神經(jīng)細(xì)胞立早基因c-fos mRNA的表達(dá)情況； 7．激光共聚焦顯微鏡檢測：用激光共聚焦顯微術(shù)檢測不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C的熒光強(qiáng)度及分布變化并進(jìn)行圖像采集和分析； 通過以上實(shí)驗(yàn)，對(duì)GP抗谷氨酸誘導(dǎo)的氧化性神經(jīng)損傷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行研究。

7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．細(xì)胞形態(tài)及MAP2免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察發(fā)現(xiàn)：剛接種的原代胎鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞呈單個(gè)圓形，均勻懸浮于培養(yǎng)液中。體外培養(yǎng)12h(DIVl2h)觀察可見絕大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)貼壁，分散均勻，胞體呈三角形或多角形，部分細(xì)胞伸出長短不等的突起，少數(shù)細(xì)胞之間已經(jīng)建立突起聯(lián)系：接種24h，胞體飽滿立體感增強(qiáng)，多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞纖維輪廓清晰且伸展較長，細(xì)胞間已經(jīng)建立了緊密的突起聯(lián)系。谷氨酸作用12 h后，大部分細(xì)胞突起消失，胞體縮成圓形，立

8、體感差，可見大量細(xì)胞碎片。GP保護(hù)組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，胞體飽滿立體感強(qiáng)，細(xì)胞間依舊保持良好的突起聯(lián)系，少見細(xì)胞皺縮破碎現(xiàn)象。細(xì)胞用MAP2抗體標(biāo)記，DAPI復(fù)染后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示：MAP2陽性細(xì)胞占培養(yǎng)細(xì)胞的90％以上，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞絕大部分為神經(jīng)元。 2．MTT法細(xì)胞活力檢測結(jié)果： (1)GP拮抗谷氨酸氧化性神經(jīng)毒性的作用時(shí)間分析表明：GP可明顯拮抗谷氨酸誘導(dǎo)的氧化性神經(jīng)毒性。GP200μg/ml于谷氨

9、酸損傷前作用12小時(shí)的保護(hù)效果明顯好于在谷氨酸損傷前作用2小時(shí)和損傷同時(shí)的保護(hù)作用，更好于損傷后的保護(hù)作用； (2)PD98059 50μM不會(huì)去除GP拮抗谷氨酸氧化性神經(jīng)損傷的保護(hù)效應(yīng)，并可在一定程度上增強(qiáng)GP的保護(hù)作用； (3)SH-6抗谷氨酸氧化性神經(jīng)毒性的作用時(shí)間和作用濃度分析表明：不同濃度的絞股藍(lán)皂苷單體SH-6于谷氨酸作用前及同時(shí)加入對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)氧化性損傷的保護(hù)作用均不明顯。SH-6在50、100、20

10、0、400μg/ml濃度時(shí)與谷氨酸損傷組細(xì)胞存活率無明顯差別。 3．生化指標(biāo)的檢測結(jié)果表明：GP可明顯拮抗谷氨酸引起的神經(jīng)細(xì)胞中谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的活力水平下降。 4．超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組神經(jīng)元形態(tài)較幼稚，核較大，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)電子密度相似，核中常染色質(zhì)豐富，呈顆粒狀分布，異染色質(zhì)少見，細(xì)胞突起較短：谷氨酸損傷組神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)溶酶體增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體數(shù)目減少：而GP保護(hù)組神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)接近于正常

11、對(duì)照組，但比正常組更顯成熟，可見胞漿內(nèi)富含糖原和脂滴，細(xì)胞突起較長。 5．流式細(xì)胞術(shù)定量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對(duì)照組相比較，谷氨酸損傷組細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERKl/2水平在谷氨酸作用后1h即明顯升高，損傷12h磷酸化ERKl/2水平下降，但仍略高于正常對(duì)照組：GP保護(hù)組細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERKl/2始終處于稍高于正常對(duì)照組的水平。 6．實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測表明：與正常對(duì)照組比較，谷氨酸損傷組立早基因c-los mRNA表達(dá)水平在

12、谷氨酸作用1h即明顯增強(qiáng)：GP保護(hù)組細(xì)胞中c-fosmRNA表達(dá)水平則明顯降低；GP+PD98059+谷氨酸組細(xì)胞內(nèi)c-fos mRNA表達(dá)水平接近于正常對(duì)照組。 7．激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞色素C熒光強(qiáng)度弱，呈顆粒狀集中在細(xì)胞核附近；谷氨酸損傷組熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，呈彌散分布；GP保護(hù)組細(xì)胞熒光強(qiáng)度減弱；GP+PD98059+谷氨酸組熒光強(qiáng)度辦減弱，接近于GP保護(hù)組。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 以體外原代培

13、養(yǎng)的胎鼠未成熟大腦皮層神經(jīng)元為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以谷氨酸為工具藥，建立谷氨酸氧化性損傷模型，研究絞股藍(lán)皂苷抗谷氨酸誘導(dǎo)的氧化性神經(jīng)損傷的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1．在該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校囵B(yǎng)48h的胎鼠大腦皮層細(xì)胞中，神經(jīng)元占90％以上： 2．GP200μg/ml能明顯拮抗谷氨酸的氧化性神經(jīng)毒性，提高細(xì)胞的存活率，并于谷氨酸作用前12h加入達(dá)最佳保護(hù)效果(與實(shí)驗(yàn)室以往結(jié)論一致)，另外，超微結(jié)構(gòu)顯示GP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有明顯的促進(jìn)生長發(fā)

14、育的作用； 3．絞股藍(lán)皂苷單體SH-6并不能拮抗谷氨酸導(dǎo)致的氧化性神經(jīng)損傷，提示絞股藍(lán)皂苷中另有其他活性成分在該保護(hù)效應(yīng)中起作用； 4．GP不僅能通過提高GSTs酶的活力調(diào)節(jié)GSH的生成，抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，來調(diào)節(jié)凋亡執(zhí)行者caspase家族成員的功能達(dá)到細(xì)胞保護(hù)的目的，而且還可能通過降低鈣內(nèi)流、減少ROS生成等環(huán)節(jié)作用于MAPK/ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，下調(diào)ERK1/2的磷酸化水平，從而抑制立早基因c．10s