胚胎干細胞誘導分化為大腦皮質(zhì)谷氨酸能神經(jīng)元的實驗研究.pdf

1、目的:谷氨酸能神經(jīng)元作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的興奮性神經(jīng)元，調(diào)節(jié)著釋放進入突觸間隙谷氨酸遞質(zhì)的量，參與了幾乎所有腦的功能。它的異常和丟失會導致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的異常，從而誘發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，諸如阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、精神分裂癥、抑郁癥、癲癇、耳聾發(fā)病等。而胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)以其可體外無限增

2、殖和全能性等生物學特性，有望為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細胞替代性治療提供細胞來源。以往的研究都集中于胚胎干細胞經(jīng)外部因素的誘導而轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元細胞，不僅方法過于復雜，而且誘導效率也較低，因此本論文擬開展研究一種新的胚胎干細胞神經(jīng)分化的誘導方法。
　　方法:1.分離BALB/c小鼠囊胚內(nèi)細胞團(Inner cell mass，ICM)，放置于飼養(yǎng)層細胞上生長，制備小鼠胚胎干細胞(mouse Embryonic stem cells，mESCs)，

3、培養(yǎng)傳代并鑒定后，凍存?zhèn)溆谩?.利用優(yōu)化的無血清懸浮培養(yǎng)法誘導mESCs向端腦前體細胞選擇分化，并用流式細胞儀檢測Bf1+和Emx1+端腦皮質(zhì)前體細胞的比例。3.PCR擴增不同分化階段細胞標志基因胚胎干細胞關(guān)鍵蛋白(0ct3/4)、巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(Tuj1)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的cDNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測其含量。4.環(huán)巴胺誘導端腦前體細胞選擇分化為VGLUT1+谷氨酸能神經(jīng)元。5.免疫熒光染色優(yōu)化法誘

4、導所得細胞的谷氨酸能神經(jīng)元標記Tuj1+和VGlUT1+。6.膜片鉗記錄檢測體內(nèi)、外VGLUT1+神經(jīng)元電生理特性。
　　結(jié)果:1）該法可使mESCs自主發(fā)生神經(jīng)細胞分化，主要依賴細胞的內(nèi)部機制和弱的內(nèi)源性細胞外信號。2）此種誘導技術(shù)能使mESCs高效分化為Bf1+端腦前體細胞，達總細胞量的70％，其中89％細胞表達皮質(zhì)標記物Emx1。3）該法能使mESCs按照一個先神經(jīng)元-后膠質(zhì)細胞的順序有效分化，與體內(nèi)胚胎神經(jīng)組織發(fā)育先后順序