Pannexin-1對星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子及谷氨酸的影響.pdf

1、目的：
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的膠質(zhì)細(xì)胞，具有支持、營養(yǎng)神經(jīng)元，維持內(nèi)外環(huán)境中pH值、神經(jīng)遞質(zhì)及離子濃度穩(wěn)定，接收、處理、傳遞信號及免疫調(diào)控等功能，其形態(tài)及功能的異常將會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境平衡的紊亂，導(dǎo)致疾病的發(fā)生與發(fā)展。縫隙連接(Gap junctions，GJs)是相鄰細(xì)胞間重要的連接通道，幾乎存在于所有動物的細(xì)胞膜上，能夠允許小分子及離子在相鄰細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞間信號傳導(dǎo)、細(xì)胞的增殖與分化、免疫炎

2、癥及缺血缺氧性損傷等生理和病理過程中起重要作用。Pannexins(Panxs)是2000年新發(fā)現(xiàn)的縫隙連接蛋白家族，Panx-1作為Panxs蛋白家族中的重要成員之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布廣泛，可以在星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上形成半通道，能夠允許分子量低于1kDa的小分子物質(zhì)如離子、代謝分子、第二信使(Ca2+、ATP等)及神經(jīng)遞質(zhì)通過。研究發(fā)現(xiàn)，Panx-1蛋白的功能與經(jīng)典的縫隙連接蛋白Connexins(Conxs)存在部分重疊，且多

3、種Conxs的拮抗劑也可作用于Panx-1，因此Panx-1可能執(zhí)行了部分既往認(rèn)為是屬于Conxs的功能，如細(xì)胞間的信號傳遞、細(xì)胞因子及谷氨酸的釋放等[6]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)及興奮-抑制環(huán)路的失衡參與了腦血管病、癲癇及神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展。因此，明確Panx-1對星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子及谷氨酸的影響將為進(jìn)一步明確以上神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制打下基礎(chǔ)。在研究中我們同時觀察到處于分裂增殖期的人腦星形膠質(zhì)母

4、細(xì)胞瘤細(xì)胞(U87 malignant glioma cells，U87-MG) Panx-1蛋白表達(dá)增高，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生作為星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的一種形式，將會導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞電生理及生物學(xué)功能發(fā)生改變[7]，因此我們采用siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)觀察Panx-1對星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖能力的影響。
　　方法：
　　本研究共分兩部分:
　　第一部分:在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞U87-MG上，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察Panx-1蛋白

5、的表達(dá)與分布;采用siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)U87-MG中Panx-1的表達(dá)，脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)及腺嘌呤核苷三磷酸(Inositol1，4，5-trisphosphate，ATP)干預(yù)U87-MG，Real-time PCR及Western Blot檢測Panx-1表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)及液相蛋白懸浮芯片(Bio-Pl

6、ex suspension army system)同步測定細(xì)胞外液中細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α)水平，高效液相色譜(High performance liquidchromatography，HPLC)檢測細(xì)胞外液中谷氨酸濃度的變化。
　　第二部分:在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞U87-MG上，采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒(Cellcounting kit-8，CCK-8)檢測Panx-1-siRNA轉(zhuǎn)染后

7、U87-MG細(xì)胞增殖能力的改變。
　　結(jié)果：
　　第一部分實(shí)驗結(jié)果:1.U87-MG上可見Panx-1蛋白表達(dá)，陽性顆粒多見于細(xì)胞漿內(nèi)，并高表達(dá)于核分裂象細(xì)胞。2.與無效序列轉(zhuǎn)染組比較，Panx-1-siRNA轉(zhuǎn)染后，Panx-1在mRNA及蛋白水平表達(dá)均下降(P＜0.05)。同時，細(xì)胞外液中IL-6、IL-8及谷氨酸濃度降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);另外細(xì)胞外液中IL-1β濃度亦降低，但未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.0

8、5)。3.LPS及ATP處理U87-MG后Panx-1蛋白表達(dá)無明顯變化，同時細(xì)胞外液中IL-1β、IL-6、IL-8及谷氨酸濃度亦無明顯改變(P＞0.05)。
　　第二部分實(shí)驗結(jié)果:與無效序列轉(zhuǎn)染組比較，Panx-1蛋白表達(dá)下調(diào)后，反映細(xì)胞增殖能力的標(biāo)志物增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)蛋白水平同步降低，同時Panx-1-siRNA轉(zhuǎn)染后U87-MG增殖能力顯著下降