SPC24基因在原發(fā)性肝細胞癌中的表達及功能的初步研究.pdf

1、目的：作為核分裂周期80（nuclear division cycle80,Ndc80）動點蛋白復合物的核心組分之一，SPC24基因參與并調(diào)控細胞有絲分裂的重大分子事件，例如：動點-微管的精準耦合、染色體的正確列隊、染色體的均等分裂等。然而，SPC24基因與原發(fā)性肝細胞癌（肝癌）（Hepatocellular carcinoma, HCC）發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移之間的關聯(lián)性仍然未知。本文旨在研究SPC24基因在肝癌組織中的表達水平，并且

2、深入地分析SPC24基因的表達與肝癌患者臨床病理參數(shù)之間的關系，為尋找新的肝癌診斷指標以及潛在的治療靶點提供可靠的實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.本研究選取2001年11月至2007年4月期間于桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院行根治性手術切除的肝癌患者。選取了212例肝癌患者的癌組織及其相應的癌旁肝組織樣本（adjacent normal liver tissues，ANLT），9例正常肝組織（選自肝血管瘤患者）樣本。
　　2.首先

3、選用普通RT-PCR方法檢測20對肝癌組織和相應癌旁組織，以及9例正常肝組織樣本中SPC24 mRNA的表達情況；進一步采用Real-time PCR分析212對肝癌及相應癌旁組織樣本中SPC24 mRNA的表達水平。
　　3.應用免疫組織化學(Immunohistoehemistry, IHC)方法檢測69對肝癌組織和相應癌旁組織，以及9例正常肝組織樣本中SPC24蛋白的表達模式；并且采用Western-blot實驗分析40對肝

4、癌組織和相應癌旁組織，以及9例正常肝組織樣本中SPC24蛋白的表達水平。
　　4. RT-PCR方法檢測12種人肝癌細胞系（ Hep3B, SK-hep1, Huh7, SMMC7721, MHCC97L, MHCC97H, PLC, HepG2, QGY7703, BEL7402, BEL7404,BEL7405）和1種正常肝細胞系（LO2）中SPC24 mRNA的表達水平，篩選出適用于細胞生物學實驗的肝癌細胞系。
　　5

5、.應用 Whitehead公司的在線設計軟件（http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/）設計3對特異性靶向SPC24基因的小干擾RNA（Small interfering RNA, siRNA）序列及1對陰性對照序列，并由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。將對數(shù)生長期的人肝癌細胞系SMMC7721和HepG2細胞接種于6孔板，待細胞融合率達到60-80％時，將針對SPC24基因的特異性siRNA轉染至SMM

6、C7721和HepG2肝癌細胞，分別提取轉染后48 h、72 h的細胞總 RNA及蛋白。并采用 RT-PCR及Western-blot實驗技術檢測轉染效果。
　　6.采用沉默肝癌細胞內(nèi)源性SPC24效果最佳的siRNA-2進行后序的細胞生物學實驗。SPC24 siRNA-2轉染至SMMC7721和HepG2肝癌細胞后，采用細胞計數(shù)CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）分析肝癌細胞增殖及粘附比例的變化

7、。
　　7. SPC24 siRNA-2轉染至SMMC7721和HepG2肝癌細胞后，采用Transwell侵襲實驗分析肝癌細胞侵襲能力的變化。
　　8. SPC24 siRNA-2轉染至SMMC7721和HepG2肝癌細胞后，選取Western-blot實驗檢測肝癌細胞中cleaved caspase-3表達量的變化，分析肝癌細胞凋亡能力的變化。
　　結果：
　　1. RT-PCR檢測的20對樣本中，與相應癌旁

8、組織比較，有18例（90％）肝癌樣本中動點相關基因SPC24 mRNA表達顯著上調(diào)，而在9例正常肝組織中SPC24mRNA表達量十分微弱。Real time PCR檢測的212對樣本中，有155例（73.1%）肝癌樣本中SPC24 mRNA表達顯著上調(diào)，而僅有57例（26.9%）SPC24 mRNA表達量呈下調(diào)狀態(tài)。肝癌組織中SPC24 mRNA表達顯著高于對應癌旁組織(mean± SD,1.123±0.072和0.350±0.036,

9、p<0.0001)。
　　2. IHC檢測69對HCC樣本中SPC24蛋白水平情況，結果顯示：有51例（73.90%）肝癌患者組織中的SPC24蛋白水平明顯高于相應的癌旁組織，而僅有22例（31.90%）癌旁肝組織中SPC24蛋白呈現(xiàn)高表達水平，同時，在9例正常肝組織中，SPC24蛋白水平呈陰性。Western-blot檢測的40對樣本中SPC24蛋白質(zhì)的表達情況，結果表明：有35例（87.50%）肝癌患者組織中的SPC24蛋白水

10、平明顯高于相對應的癌旁組織，而在9例正常肝組織中，SPC24蛋白水平極低，或檢測不到。
　　3.RT-PCR檢測結果顯示：SPC24 mRNA在人肝癌細胞系Hep3B，Huh7， SMMC7721，MHCC97H，PLC，HepG2，QGY7703，BEL7404，BEL7405中表達明顯上調(diào)，而在LO2，MHCC97L，SK-hep1，BEL7402等細胞系中則表達相對較弱。
　　4.RT-PCR和Western Blot

11、ting檢測結果顯示：用針對SPC24基因的特異性siRNAs干擾人肝癌細胞系SMMC7721和HepG2后，肝癌細胞中內(nèi)源性SPC24mRNA和蛋白質(zhì)表達水平明顯降低。并且，SPC24 siRNA-2的靶向沉默效果最佳，所以我們選用SPC24 siRNA-2進行后序的細胞生物學實驗。
　　5.與siRNA陰性對照組比較，SPC24 siRNA-2顯著抑制人肝癌細胞系SMMC7721和HepG2細胞的生長能力、粘附能力、和侵襲能力

12、。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)轉染SPC24 siRNA-2的肝癌細胞中cleaved caspase-3表達量明顯上調(diào)，表明沉默肝癌細胞內(nèi)源性SPC24基因后可引發(fā)細胞凋亡事件。
　　6.相關性分析結果顯示：肝癌組織中SPC24 mRNA的高表達水平與血清甲胎蛋白水平（alpha-fetoprotein, AFP）（>200 ng/ml）、較大的腫瘤、多發(fā)腫瘤、以及巴塞羅那臨床肝癌分期（barcelona clinic li

13、ver cancer staging classification，BCLC）為B-C期等因素呈正相關（p<0.05）。
　　7.采用Kaplan-Meier曲線評估，我們發(fā)現(xiàn)，與低表達SPC24的患者比較，高表達SPC24的患者術后無瘤生存時間（disease-free survival, DFS）(p<0.001)和總生存時間（overall survival, OS）(p=0.001)更短。多因素分析顯示，SPC24表達上調(diào)